OK Clon DNA 连接试剂盒 II

¥580.00¥2,400.00

货号AG11807 / AG11808
分类克隆系列、无缝克隆

产品详情

产品描述

OK Clon DNA Ligation Kit II 是一种准确、快速、高效的定向克隆试剂盒。本试剂盒可以在 10 分钟内,快速高效地将一段或多段 DNA 片段定向、无缝的克隆到任意载体的任意位置,而不被酶切位点限制。本产品是在 OK Clon DNA Ligation Kit(Code. AG11802 / AG11803)的基础上进行了优化,适用范围更广,尤其适合大载体、大片段及多片段的连接。DNA 连接反应是基于 OK Clon Enzyme 3’- 5’端的外切酶活性,从线性化 DNA 链的 3’ 末端切割核苷酸形成粘性末端,由此,片段与载体末端能够形成 15 ~ 20bp 的互补序列,通过退火可以准确、高效的将片段与载体连接。只需在设计引物时将与载体 5’ 端互补的序列添加在引物 5’ 端,通过该引物扩增目的片段,无需对 PCR 片段进行限制酶切、磷酸化等处理,就可将目的片段插入载体中。

产品优势

① 可将片段插入载体的任意位置,而不受酶切位点限制;
② 反应迅速,50℃ 10min 即可完成连接反应;
③ 适用范围更广,适用于各种大小的载体与片段的连接;特别适合大载体、大片段及多片段的连接;
④ 插入片段不需酶切处理,PCR 扩增完成后只需要进行纯化处理便可直接进行连接反应。

产品组成
组分 AG11807 AG11808
2.5X OK Clon Master Mix 40μl 100μl x 2pc
Linearized Control vector (50ng / μl) 5μl 5μl
2kb Positive Control Insert (80ng / μl) 5μl 5μl
保存与运输

保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

本试剂盒中载体与片段的克隆实验
① 按照下表配制反应体系:

组分名称 实验组 阴性对照 阳性对照*1
2.5X OK Clon Master Mix 4μl 4μl 4μl
Linearized Control vector (50 ng / μl) 1μl 1μl /
2kb Positive Control Insert (80ng / μl) 1μl / /
RNase free water 4μl 5μl Up to 10μl

*1:阳性对照仅加入 100pg 环状的 pUC19 质粒。不加线性化载体与片段。

② 将所有组别转化至 E.coli JM109 Competent cells(Code. AG11805),培养的菌悬浮液稀释 5 倍后,100μl 涂布平板。结果如下图所示,实验组的菌落均匀,得到数百个单克隆菌落。

③ 挑取实验组 12 个单菌落,进行菌落 PCR 验证。从下图电泳结果可看出,所挑取 12 个菌落均为阳性菌落。

④ 将菌落 PCR 验证为阳性的 12 个菌落进行质粒提取后测序,序列正确无误。

产品说明书

Q1:目的片段检测

Answer: 应对扩增的目的片段进行琼脂糖凝胶,判断条带大小是否正确;将正确的条带凝胶回收纯化,再次跑胶确保无误,并粗略计算回收后的片段浓度。

Q2:载体线性化方法

Answer: 线性化载体可通过酶切或反向 PCR 扩增制备,线性化载体建议跑胶判断大小无误,纯化后备用。

Q3:引物如何设计?

Answer: OK Clon实验在引物设计时,需要在引物的 5' 端加入酶切位点及与载体同源臂序列;若是多片段连接克隆,但每条片段之间都应有 15 ~ 20 bp 的同源互补序列接头。
● 引物由三部分组成:同源臂(15 ~ 20 bp,建议 GC 含量 40% ~ 60%)+ 酶切位点(按需保留或舍弃)+ 特异性引物序列,可以通过 OK Clon 引物设计小工具,自动生成插入片段的扩增引物。

Q4:插入片段的量多少合适?

Answer: 片段加入量可根据片段长度不同进行调整,片段的加入量可根据插入片段与载体的摩尔比进行添加(参考比例为插入片段与载体的摩尔比)。

片段长度 < 载体长度 片段长度 ≥ 载体长度
单个片段 2:1
(若插入片段 < 500 bp,可在2:1~5:1范围内进行调整)
1:1
多个片段 各片段与载体摩尔比建议2:1 各片段与载体摩尔比建议2:1

Q5:连接时间多长合适?

Answer: 大多数情况下,建议反应 10 min 即可,如果连接效果不好,可在 8 min~10 min 范围内调整,优化反应效率。对于比较复杂的接头(如接头 GC 含量较高),可尝试延长反应时间至 12 min;对于简单的接头(如 AT 含量较高),可尝试降低反应时间至 8 min。

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