本制品是用于植物直接 PCR 反应的 2 倍浓度预混型试剂,具有较快的延伸速度(可达10sec / kb),可进行快速PCR反应。同时,本制品有较强的扩增性能,非常适合对各种植物样品直接或简单裂解后进行 PCR 扩增,无需DNA 纯化步骤,极大地缩短了实验时长、节约成本。简单裂解可使用碱裂解或蛋白酶K裂解方法,如选用蛋白酶K裂解方法,可选用本公司产品 Lysis Buffer for PCR(Code No. AG12306 和 AG12307)。
进行 PCR 反应时,只需向预混液中加入模板、引物和水即可进行扩增;本制品中含有电泳所必需的色素试剂,制品溶液呈现鲜艳的绿色;PCR 反应完毕后可以直接进行琼脂糖凝胶电泳。这种预混液方案操作简便,可最大限度地减少人为误差,并在较短时间内即可获得检测结果。
本制品中还添加了在常温状态下能够抑制 DNA polymerase 活性的单克隆抗体,可以进行 Hot Start PCR,有效的抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。本制品扩增得到的产物 3’ 端不含 A 碱基,因此不可直接用于 TA 克隆。
产品优势
① 本制品具有较强的扩增性能,适用于各种植物样本直接或简单裂解后进行 PCR 扩增;无需 DNA 纯化步骤,缩短实验时长、节约成本。直接以水稻叶片为模板,可扩增出长达 12kb 的 DNA 片段。
② 本制品具有较快的延伸速度(可达 10sec / kb),在较短时间内即可获得检测结果。
③ 本制品是 2 倍浓度的预混液,仅需添加模板、引物与水即可进行 PCR 扩增,操作简便,减少人为误差,大大提高了实验效率。
④ 本制品中含有绿色染料,PCR 结束后可直接进行琼脂糖凝胶电泳,无需添加电泳上样缓冲液,电泳时有两条指示带(蓝色和黄色)。
Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。
Q4:PCR 用引物的使用量
Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。
Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增
Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。
Q6:PCR 目的条带无扩增
Answer:
可能原因
建议
DNA模板
① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。 ② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构
可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段
可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。