AdeptTect 植物快速直接 PCR 预混液(含染料)

¥600.00

货号AG12305
分类一般PCR系列、直接扩增PCR系列

产品详情

产品描述

本制品是用于植物直接 PCR 反应的 2 倍浓度预混型试剂,具有较快的延伸速度(可达10sec / kb),可进行快速PCR反应。同时,本制品有较强的扩增性能,非常适合对各种植物样品直接或简单裂解后进行 PCR 扩增,无需DNA 纯化步骤,极大地缩短了实验时长、节约成本。简单裂解可使用碱裂解或蛋白酶K裂解方法,如选用蛋白酶K裂解方法,可选用本公司产品 Lysis Buffer for PCR(Code No. AG12306 和 AG12307)。
进行 PCR 反应时,只需向预混液中加入模板、引物和水即可进行扩增;本制品中含有电泳所必需的色素试剂,制品溶液呈现鲜艳的绿色;PCR 反应完毕后可以直接进行琼脂糖凝胶电泳。这种预混液方案操作简便,可最大限度地减少人为误差,并在较短时间内即可获得检测结果。
本制品中还添加了在常温状态下能够抑制 DNA polymerase 活性的单克隆抗体,可以进行 Hot Start PCR,有效的抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。本制品扩增得到的产物 3’ 端不含 A 碱基,因此不可直接用于 TA 克隆。

产品优势

① 本制品具有较强的扩增性能,适用于各种植物样本直接或简单裂解后进行 PCR 扩增;无需 DNA 纯化步骤,缩短实验时长、节约成本。直接以水稻叶片为模板,可扩增出长达 12kb 的 DNA 片段。
② 本制品具有较快的延伸速度(可达 10sec / kb),在较短时间内即可获得检测结果。
③ 本制品是 2 倍浓度的预混液,仅需添加模板、引物与水即可进行 PCR 扩增,操作简便,减少人为误差,大大提高了实验效率。
④ 本制品中含有绿色染料,PCR 结束后可直接进行琼脂糖凝胶电泳,无需添加电泳上样缓冲液,电泳时有两条指示带(蓝色和黄色)。

产品组成
组分 规格
2X Plant Fast Direct PCR Master Mix (dye plus) 500μl × 6pc
保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

采用本试剂盒对西红柿、水稻叶片样本直接进行 PCR 扩增,可获得较好的扩增效果。

反应程序:

*:西红柿 0.6kb、1.6kb 延伸速度 10sec / kb;3kb延伸速度 30sec / kb;
*:水稻叶片 1.1kb、3kb、5kb 延伸速度 10sec / kb;7.5kb、12kb 延伸速度 20sec / kb。

电泳结果如下图所示:

示例二

将菠菜叶片、水稻叶片、土豆块茎等用蛋白酶 K 法简单裂解 【使用本公司产品 Lysis Buffer for PCR(Code No. AG12306)】,并以裂解产物为模板,采用本试剂盒扩增不同的 DNA 片段,都能获得很好的扩增效果。

反应程序:

*:水稻叶片延伸速度为 10sec / kb;
*:菠菜叶片延伸速度为 15sec / kb;
*:土豆块茎1 kb延伸速度为 10sec / kb ,10kb 延伸速度为 18sec / kb。

电泳结果如下图所示:

实验例表
模板类型 扩增速度 片段大小 序列GC含量 简单裂解 直接PCR
裂解后的模板量*2 能否扩增*1 直接模板量*1 能否扩增*1
水稻叶片 10sec /kb 1kb 45.6% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
水稻叶片 10sec /kb 3kb 41.5% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
水稻叶片 15sec /kb 5kb 40.5% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
水稻叶片 20sec /kb 7.5kb 46.8% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
水稻叶片 20sec /kb 12kb 44.6% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
土豆块茎 10sec /kb 1.3kb 39.5% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 块茎简单裂解)
5-10mm3
土豆块茎 15sec /kb 2kb 39.6% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 块茎简单裂解)
5-10mm3
土豆块茎 15sec /kb 2.9kb 38.2% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 块茎简单裂解)
5-10mm3
土豆块茎 15sec /kb 5.8kb 35.4% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 块茎简单裂解)
5-10mm3
土豆块茎 30sec /kb 10kb 38.0% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 块茎简单裂解)
5-10mm3
菠菜叶片 10sec /kb 0.7kb 38.9% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
菠菜叶片 10sec /kb 1kb 42.3% 2-4μl裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
菠菜叶片 15sec /kb 5kb 33.4% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
菠菜叶片 15sec /kb 10kb 35.1% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
4-10mm2
西红柿果肉 10sec /kb 0.5kb 28.2% 2-4μl 裂解液
(2μl 果肉简单裂解)
2μl
西红柿果肉 10sec /kb 1.6kb 32.2% 2-4μl 裂解液
(2μl 果肉简单裂解)
2μl
西红柿果肉 10sec /kb 1.9kb 36.0% 2-4μl 裂解液
(2μl 果肉简单裂解)
× ×
西红柿果肉 15sec /kb 3kb 37.4% 2-4μl 裂解液
(2μl 果肉简单裂解)
2μl
西红柿果肉 20sec /kb 4.4kb 37.6% 2-4μl 裂解液
(2μl 果肉简单裂解)
2μl
西红柿果肉 20sec /kb 5kb 38.2% 2-4μl 裂解液
(2μl 果肉简单裂解)
2μl
西红柿果肉 30sec /kb 5.8kb 37.6% 2-4μl 裂解液
(2μl 果肉简单裂解)
× ×
拟南芥叶片 24sec /kb 2.2kb 35.2% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
/ /
拟南芥叶片 24sec /kb 3kb 41.0% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
/ /
拟南芥叶片 24sec /kb 5kb 38.0% 2-4μl 裂解液
(4-10mm2 叶片简单裂解)
/ /
玉米粒 15sec /kb  kb 52.4% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 胚组织简单裂解)
× ×
玉米粒 20sec /kb 1.8kb 48.0% 2-4 μl 裂解液
(5-10mm3 胚组织简单裂解)
× ×
玉米粒 15sec /kb 3kb 56.0% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 胚组织简单裂解)
× ×
玉米粒 15sec /kb 4.4kb 55.0% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 胚组织简单裂解)
× ×
玉米粒 15sec /kb 5.7kb 58.4% 2-4μl 裂解液
(5-10mm3 胚组织简单裂解)
× ×

*1:√表示能够扩增,× 表示未扩增出目的条带,/ 表示未进行扩增。
*2:简单裂解使用本公司制品 Lysis Buffer for PCR(Code. AG12306)。

产品说明书

Q1:PCR 出现非特异性扩增条带

Answer:

可能原因 建议
引物浓度 引物加入量通常在 0.1 μM – 1 μM 范围内,建议按照说明书推荐量添加引物,如需要调整引物浓度,建议进行梯度调整。
引物设计 建议对设计好的引物进行特异性评估,如引物存在问题应重新设计引物,PCR 实验建议引物长度在 20 - 30 mer 左右,以增强实验特异性。
酶量 可适当减少 DNA 聚合酶的使用量。
反应程序 如果杂带比目的条带小,可适当提高退火温度,降低循环数进行优化;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。
模板 检查模板是否存在污染或降解,确认模板加入量是否在说明书推荐范围之内。

Q2:PCR 产物电泳时条带弥散

Answer:

可能原因 建议
电泳条件 可能是由于电泳时间过长或者电压不稳导致,建议检查电压,适当缩短电泳时间。
退火温度 设置梯度调整退火温度,摸索最适退火温度。
循环次数过多 可适当减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间。
酶量过高 可适当降低酶量。
引物浓度不够优化 建议对引物设置浓度梯度后进行 PCR 反应。

Q3:PCR 引物设计的一般建议

Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。

Q4:PCR 用引物的使用量

Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。

Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增

Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。

Q6:PCR 目的条带无扩增

Answer:

可能原因 建议
DNA模板 ① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。
② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构 可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段 可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。
引物 检查引物设计是否合理,确保引物针对目的片段具有特异性;可将引物分装保存,防止多次冻融或长期 4℃ 保存,导致引物降解失效;优化引物使用量。
可更换新酶验证酶是否失活或活性降低导致目的条带无扩增。
Mg2+ 浓度 若有需要可适当调整 Buffer 体系中的 Mg2+ 浓度,Mg2+ 浓度过高会降低 PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增效率。
反应程序 优化 DNA 模板变性时间和温度(如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活;温度过低则模板变性不彻底);可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度;选择适合于目的片段长度的延伸时间。

Q7:标注 dye plus 的染料有什么作用?如果需要对产物进行回收会影响产物质量吗?

Answer: 使用艾科瑞生物所有标注(dye plus)的 PCR 试剂是指反应体系中已添加电泳检测时所需的染料试剂,PCR 产物进行电泳时无需额外添加 loading buffer ,完成反应后可直接点样进行凝胶电泳;染料仅用于指示电泳进行的程度,带染料的 PCR 产物不会影响回收产物的质量。

Q8:PCR 系列产品的产物是否带 A 尾

Answer: 使用 Accurate TaqPro TaqExp Taq 系列产品得到的 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体;使用高保真 PCR、快速 PCR 以及直扩 PCR 系列产品得到的产物是平末端,不可直接进行 T 载连接,可在反应产物中加入少量 Taq 酶,72℃ 反应 30 ~ 40 min,即可为产物加上 A 尾。

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