ApexHF HS DNA Polymerase CL 是一款具有高特异性及优良扩增性的高保真 DNA 聚合酶。本制品对简单或复杂模板、短片段或长片段 PCR 扩增都具有良好的适应性,特别适用于长片段 PCR 扩增,同时,对于高 GC 含量、高 AT 含量及低起始量的模板都能进行有效的扩增。本制品中还添加了在常温状态下能够抑制 DNA Polymerase 活性的单克隆抗体,可以进行 Hot Start PCR ,有效的抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。本制品中的反应体系经过了优化,对粗提样本也能进行很好的扩增。
产品优势
① ApexHF HS DNA Polymerase CL 是一种高保真 DNA 聚合酶,扩增效率高。
② 非常适合长片段扩增,以 λDNA 为模板,可扩增长达 40kb 的 DNA 片段;以 Human gDNA 为模板,可扩增长达约 32kb 的 DNA 片段。
③ 本品中添加了能够抑制 DNA polymerase 活性的单克隆抗体,可以进行热启动反应。在进行 PCR 反应前,抗体与酶结合抑制 DNA 聚合酶的活性,有效抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。
④ 优化的反应体系,对简单或复杂模板、短片段或长片段 PCR 扩增都具有良好的适应性。对于高 GC 含量、高 AT 含量及低起始量的模板都能进行有效的扩增。
Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。
Q4:PCR 用引物的使用量
Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。
Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增
Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。
Q6:PCR 目的条带无扩增
Answer:
可能原因
建议
DNA模板
① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。 ② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构
可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段
可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。