ApexHF HS DNA 聚合酶预混液 - FS

¥350.00

货号AG12202
分类一般PCR系列、高保真PCR系列

产品详情

产品描述
本制品是 ApexHF HS DNA Polymerase FS 即用型的 2 倍浓度 PCR 反应预混液。进行 PCR 反应时，只需向预混液中加入模板和引物即可进行扩增。这种预混液方案操作简便，在常温下即可快速配置反应液，可最大限度地减少人为误差，在较短时间内即可获得检测结果。本制品具有高扩增效率、高灵敏度、高特异性、高退火效率及延伸速度快等特点，可进行快速 PCR 反应。此外，本制品中还添加了在常温状态下能够抑制 DNA polymerase 活性的单克隆抗体，可以进行 Hot Start PCR，有效抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。
产品优势
① ApexHF HS DNA Polymerase FS 是一种高保真 DNA 聚合酶，具有高扩增效率、高灵敏度、高特异性、高退火效率及延伸速度快等特点。
② 延伸速度快，以 Human gDNA 为模板，10sec 的延伸时间，可扩增出长达 4kb 的 DNA片段；进行菌落 PCR 时，10sec 的延伸时间，可扩增出长达 7kb 的 DNA 片段。
③ 本品中添加了能够抑制 DNA polymerase 活性的单克隆抗体，可以进行热启动反应。在进行 PCR 反应前，抗体与酶结合抑制 DNA 聚合酶的活性，有效抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。
④ 本制品是 2X 的预混液，仅需添加模板与引物即可进行 PCR 扩增，操作简便，减少人为误差。
⑤ 优化的反应体系，退火效率高，延伸速度快，可提高 PCR 反应效率。
产品组成
组分 规格
2X ApexHF FS PCR Master Mix* 500μl x 5pc

*2X ApexHF FS PCR Master Mix中的 Mg2＋浓度为 2mM， dNTPs 的浓度为 400μM 。

保存与运输
保存温度：-20℃
运输温度：干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

采用本试剂盒进行菌落 PCR 扩增，以不同的延伸速度扩增不同长度的 DNA 片段，可以 10sec 的延伸时间扩增出 7kb 的 DNA 片段。

电泳结果如下图所示：

示例二

以 λDNA 为模板，采用本试剂盒以不同的延伸速度扩增不同长度的 DNA 片段，以 10sec 的延伸时间可很好的扩增出 4kb DNA 片段；以 30sec 的延伸时间可很好的扩增出 10kb DNA 片段。

电泳结果如下图所示：

示例三

以 cDNA 为模板，采用本试剂盒以不同的延伸速度扩增不同长度的 DNA 片段，以 10sec 的延伸时间可很好的扩增出 6kb DNA 片段；以 30sec 的延伸时间可很好的扩增出 8kb DNA 片段。

电泳结果如下图所示：

示例四

以 cDNA 为模板，添加不同模板量（相当于 Total RNA 的量），采用本试剂盒扩增 4kb 的 DNA 片段，在进行快速扩增时（延伸时间 20sec），模板量 12.5ng（相当于 Total RNA量），可很好地扩增出的 4kb DNA 片段；当延伸时间延长，扩增出的 DNA 量会增加。

电泳结果如下图所示：

示例五

以 Human gDNA 为模板，添加不同模板量（100pg、1ng、10ng、100ng、500ng），采用本试剂盒扩增 4kb DNA 片段，模板量低至 1ng 时，可扩增出 4kb DNA 片段。

电泳结果如下图所示：

产品说明书

Q1：PCR 出现非特异性扩增条带

Answer:

可能原因 建议
引物浓度 引物加入量通常在 0.1 μM – 1 μM 范围内，建议按照说明书推荐量添加引物，如需要调整引物浓度，建议进行梯度调整。
引物设计 建议对设计好的引物进行特异性评估，如引物存在问题应重新设计引物，PCR 实验建议引物长度在 20 - 30 mer 左右，以增强实验特异性。
酶量 可适当减少 DNA 聚合酶的使用量。
反应程序 如果杂带比目的条带小，可适当提高退火温度，降低循环数进行优化；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。
模板 检查模板是否存在污染或降解，确认模板加入量是否在说明书推荐范围之内。

Q2：PCR 产物电泳时条带弥散

Answer:

可能原因 建议
电泳条件 可能是由于电泳时间过长或者电压不稳导致，建议检查电压，适当缩短电泳时间。
退火温度 设置梯度调整退火温度，摸索最适退火温度。
循环次数过多 可适当减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间。
酶量过高 可适当降低酶量。
引物浓度不够优化 建议对引物设置浓度梯度后进行 PCR 反应。

Q3：PCR 引物设计的一般建议

Answer: ① 引物长度通常在 20～30 nt。
② 引物GC含量在 40～60%，碱基随机分布，避开局部富含 GC 或 AT；引物之间不应有互补性，以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间，上下游引物的 GC 含量尽量保持接近，Tm 值相差一般不超过 5℃。

Q4：PCR 用引物的使用量

Answer: ① PCR 反应中，使用引物的终浓度可以在 0.1 μM～1.0 μM 之间选择，引物的浓度太低时，会导致扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整，模板添加量较多时，建议适当降低引物的浓度，当模板 DNA 的量较少时，建议提高引物的浓度。

Q5：如何避免 PCR 出现假阳性扩增

Answer: ① 进行 PCR 实验时，建议划分独立的实验区域，配制 PCR 反应体系时做好防污染工作，避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照，以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。

Q6：PCR 目的条带无扩增

Answer:

可能原因 建议
DNA模板 ① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测（cDNA 模板不建议测浓度），并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性，如 DNA 模板为粗提模板，可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。
② 若模板 DNA 浓度太低，应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构 可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒；适当增加变性时间或温度 ，高效解离双链 DNA 模板。
长片段 可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶；适当降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性；根据扩增片段长度，增加延伸时间。
引物 检查引物设计是否合理，确保引物针对目的片段具有特异性；可将引物分装保存，防止多次冻融或长期 4℃ 保存，导致引物降解失效；优化引物使用量。
酶 可更换新酶验证酶是否失活或活性降低导致目的条带无扩增。
Mg2+ 浓度 若有需要可适当调整 Buffer 体系中的 Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度过高会降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增效率。
反应程序 优化 DNA 模板变性时间和温度（如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活；温度过低则模板变性不彻底）；可对退火温度设置梯度，摸索最佳的退火温度；选择适合于目的片段长度的延伸时间。

Q7：标注 dye plus 的染料有什么作用？如果需要对产物进行回收会影响产物质量吗？

Answer: 使用艾科瑞生物所有标注（dye plus）的 PCR 试剂是指反应体系中已添加电泳检测时所需的染料试剂，PCR 产物进行电泳时无需额外添加 loading buffer ，完成反应后可直接点样进行凝胶电泳；染料仅用于指示电泳进行的程度，带染料的 PCR 产物不会影响回收产物的质量。

Q8：PCR 系列产品的产物是否带 A 尾

Answer: 使用 Accurate Taq、Pro Taq、Exp Taq 系列产品得到的 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基，可直接克隆于 T 载体；使用高保真 PCR、快速 PCR 以及直扩 PCR 系列产品得到的产物是平末端，不可直接进行 T 载连接，可在反应产物中加入少量 Taq 酶，72℃ 反应 30 ~ 40 min，即可为产物加上 A 尾。

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