ApexHF HS DNA 聚合酶 - FS

¥200.00

货号AG12201
分类一般PCR系列、高保真PCR系列

产品详情

产品描述
ApexHF HS DNA Polymerase FS 是一种高保真 DNA 聚合酶,具有高扩增效率、高灵敏度、高特异性、高退火效率及延伸速度快等特点。本制品中的 PCR 反应体系经过了优化,添加了独特的延伸因子,提高了退火效率与延伸速度,从而缩短了延伸时间,大大减少了 PCR 反应的时间,可进行快速的 PCR 反应。此外,本制品中还添加了在常温状态下能够抑制  DNA Polymerase  活性的单克隆抗体,可以进行 Hot Start PCR ,有效抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。
产品优势
ApexHF HS DNA Polymerase FS 是一种高保真 DNA 聚合酶,具有高扩增效率、高灵敏度、高特异性、高退火效率及延伸速度快等特点。
② 延伸速度快,以 Human gDNA 为模板,10sec 的延伸时间,可扩增长达 4kb 的 DNA片段;进行菌落 PCR 时,10sec 的延伸时间,可扩增出长达 7kb 的 DNA 片段。
③ 本品中添加了能够抑制 DNA polymerase 活性的单克隆抗体,可以进行热启动反应。在进行 PCR 反应前,抗体与酶结合抑制 DNA 聚合酶的活性,有效抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。
④ 优化的反应体系,缩短延伸时间,提高 PCR 反应效率。
产品组成
组分 规格
ApexHF HS DNA Polymerase FS (1U / μl) 50μl
5X ApexHF FS Buffer (Mg2+ plus)* 500μl
dNTP Mix (10mM each) 50μl

*5X ApexHF FS Buffer (Mg2+ plus)中的 Mg2+浓度为 5mM。

保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

以 Human gDNA 为模板,添加不同的模板量,采用本试剂盒以不同的延伸速度扩增 4kb的 DNA 片段。以 2.5sec / kb 进行快速扩增,模板量 1ng 时,可扩增出 4kb DNA 片段;当延伸时间延长,扩增出的 DNA 量会增加。

电泳结果如下图所示:

示例二

以 λDNA 与 Human gDNA 为模板,采用本试剂盒以 10sec / kb 的延伸速度,扩增不同长度的 DNA 片段。Human gDNA 为模板可很好地扩增出 4kb DNA 片段,λDNA 为模板可很好地扩增出 6kb DNA 片段。

电泳结果如下图所示:

产品说明书

Q1:PCR 出现非特异性扩增条带

Answer:

可能原因 建议
引物浓度 引物加入量通常在 0.1 μM – 1 μM 范围内,建议按照说明书推荐量添加引物,如需要调整引物浓度,建议进行梯度调整。
引物设计 建议对设计好的引物进行特异性评估,如引物存在问题应重新设计引物,PCR 实验建议引物长度在 20 - 30 mer 左右,以增强实验特异性。
酶量 可适当减少 DNA 聚合酶的使用量。
反应程序 如果杂带比目的条带小,可适当提高退火温度,降低循环数进行优化;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。
模板 检查模板是否存在污染或降解,确认模板加入量是否在说明书推荐范围之内。

Q2:PCR 产物电泳时条带弥散

Answer:

可能原因 建议
电泳条件 可能是由于电泳时间过长或者电压不稳导致,建议检查电压,适当缩短电泳时间。
退火温度 设置梯度调整退火温度,摸索最适退火温度。
循环次数过多 可适当减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间。
酶量过高 可适当降低酶量。
引物浓度不够优化 建议对引物设置浓度梯度后进行 PCR 反应。

Q3:PCR 引物设计的一般建议

Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。

Q4:PCR 用引物的使用量

Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。

Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增

Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。

Q6:PCR 目的条带无扩增

Answer:

可能原因 建议
DNA模板 ① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。
② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构 可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段 可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。
引物 检查引物设计是否合理,确保引物针对目的片段具有特异性;可将引物分装保存,防止多次冻融或长期 4℃ 保存,导致引物降解失效;优化引物使用量。
可更换新酶验证酶是否失活或活性降低导致目的条带无扩增。
Mg2+ 浓度 若有需要可适当调整 Buffer 体系中的 Mg2+ 浓度,Mg2+ 浓度过高会降低 PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增效率。
反应程序 优化 DNA 模板变性时间和温度(如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活;温度过低则模板变性不彻底);可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度;选择适合于目的片段长度的延伸时间。

Q7:标注 dye plus 的染料有什么作用?如果需要对产物进行回收会影响产物质量吗?

Answer: 使用艾科瑞生物所有标注(dye plus)的 PCR 试剂是指反应体系中已添加电泳检测时所需的染料试剂,PCR 产物进行电泳时无需额外添加 loading buffer ,完成反应后可直接点样进行凝胶电泳;染料仅用于指示电泳进行的程度,带染料的 PCR 产物不会影响回收产物的质量。

Q8:PCR 系列产品的产物是否带 A 尾

Answer: 使用 Accurate TaqPro TaqExp Taq 系列产品得到的 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体;使用高保真 PCR、快速 PCR 以及直扩 PCR 系列产品得到的产物是平末端,不可直接进行 T 载连接,可在反应产物中加入少量 Taq 酶,72℃ 反应 30 ~ 40 min,即可为产物加上 A 尾。

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