Exp Taq DNA 聚合酶(含GC Buffer)

¥280.00

货号AG11511
分类一般PCR系列、高GC PCR系列

产品详情

产品描述
本制品是专门针对高 GC 含量模板设计的 PCR 扩增产品,对 DNA Polymerase、反应 buffer 进行优化,非常适合于富含 GC 序列或含有重复序列的基因组 DNA 和 cDNA 模板的扩增;同时,制品具有错配率低以及扩增性能强的特点。使用本制品扩增得到的大部分 PCR 产物 3’端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体。
为了获得更好的扩增效果,本制品配有两种反应 Buffer:2X GC buffer I 与 2X GC buffer II;一般情况下建议先使用 2X GC buffer I 进行 PCR 扩增,如果不能得到理想的结果,可再使用 2X GC buffer II 进行尝试。
产品优势

① 本制品是专门针对高 GC 含量模板设计的 PCR 扩增产品 DNA Polymerase、反应 buffer都经过优化,非常适合于复杂结构,富含 GC 序列或含有重复序列的基因组 DNA 和 cDNA模板扩增。
② 大部分 PCR 产物 3’端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体。
③ 扩增不同类型模板的高 GC 基因均具有良好的性能。

产品组成
组分 规格
Exp Taq DNA Polymerase (5U / μl) 25μl
2X GC buffer I 625μl x 2pc
2X GC buffer II 625μl x 2pc
dNTP Mix (10mM each) 100μl
保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

以 Human gDNA 为模板,分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 和 2X GC buffer II 扩增不同 GC 含量的 DNA 片段。

反应程序:

电泳结果如下图所示:

示例二

以小鼠 gDNA 为模板,分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 和 2X GC buffer II 扩增不同GC 含量的 DNA 片段。

反应程序:

电泳结果如下图所示:

示例三

以猪 gDNA 为模板,分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 和 2X GC buffer II 扩增不同 GC含量的 DNA 片段。

反应程序:

电泳结果如下图所示:

示例四

以鸡或玉米 gDNA 为模板,分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 和 2X GC buffer II 扩增不同 GC 含量的 DNA 片段。

反应程序:

电泳结果如下图所示:

示例五

以小鼠 gDNA 为模板,添加不同模板量(500ng、100ng、10ng、1ng),分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 扩增 1658bp DNA 片段(GC 含量 65%)和 2X GC buffer II 扩增 1166bp DNA 片段(GC 含量 70.8%),模板量低至 1ng 时,都可扩增出目的片段。

反应程序:

电泳结果如下图所示:

产品说明书

Q1:PCR 出现非特异性扩增条带

Answer:

可能原因 建议
引物浓度 引物加入量通常在 0.1 μM – 1 μM 范围内,建议按照说明书推荐量添加引物,如需要调整引物浓度,建议进行梯度调整。
引物设计 建议对设计好的引物进行特异性评估,如引物存在问题应重新设计引物,PCR 实验建议引物长度在 20 - 30 mer 左右,以增强实验特异性。
酶量 可适当减少 DNA 聚合酶的使用量。
反应程序 如果杂带比目的条带小,可适当提高退火温度,降低循环数进行优化;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。
模板 检查模板是否存在污染或降解,确认模板加入量是否在说明书推荐范围之内。

Q2:PCR 产物电泳时条带弥散

Answer:

可能原因 建议
电泳条件 可能是由于电泳时间过长或者电压不稳导致,建议检查电压,适当缩短电泳时间。
退火温度 设置梯度调整退火温度,摸索最适退火温度。
循环次数过多 可适当减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间。
酶量过高 可适当降低酶量。
引物浓度不够优化 建议对引物设置浓度梯度后进行 PCR 反应。

Q3:PCR 引物设计的一般建议

Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。

Q4:PCR 用引物的使用量

Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。

Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增

Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。

Q6:PCR 目的条带无扩增

Answer:

可能原因 建议
DNA模板 ① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。
② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构 可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段 可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。
引物 检查引物设计是否合理,确保引物针对目的片段具有特异性;可将引物分装保存,防止多次冻融或长期 4℃ 保存,导致引物降解失效;优化引物使用量。
可更换新酶验证酶是否失活或活性降低导致目的条带无扩增。
Mg2+ 浓度 若有需要可适当调整 Buffer 体系中的 Mg2+ 浓度,Mg2+ 浓度过高会降低 PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增效率。
反应程序 优化 DNA 模板变性时间和温度(如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活;温度过低则模板变性不彻底);可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度;选择适合于目的片段长度的延伸时间。

Q7:标注 dye plus 的染料有什么作用?如果需要对产物进行回收会影响产物质量吗?

Answer: 使用艾科瑞生物所有标注(dye plus)的 PCR 试剂是指反应体系中已添加电泳检测时所需的染料试剂,PCR 产物进行电泳时无需额外添加 loading buffer ,完成反应后可直接点样进行凝胶电泳;染料仅用于指示电泳进行的程度,带染料的 PCR 产物不会影响回收产物的质量。

Q8:PCR 系列产品的产物是否带 A 尾

Answer: 使用 Accurate TaqPro TaqExp Taq 系列产品得到的 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体;使用高保真 PCR、快速 PCR 以及直扩 PCR 系列产品得到的产物是平末端,不可直接进行 T 载连接,可在反应产物中加入少量 Taq 酶,72℃ 反应 30 ~ 40 min,即可为产物加上 A 尾。

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