本制品是专门针对高 GC 含量模板设计的 PCR 扩增产品,对 DNA Polymerase、反应 buffer 进行优化,非常适合于富含 GC 序列或含有重复序列的基因组 DNA 和 cDNA 模板的扩增;同时,制品具有错配率低以及扩增性能强的特点。使用本制品扩增得到的大部分 PCR 产物 3’端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体。
为了获得更好的扩增效果,本制品配有两种反应 Buffer:2X GC buffer I 与 2X GC buffer II;一般情况下建议先使用 2X GC buffer I 进行 PCR 扩增,如果不能得到理想的结果,可再使用 2X GC buffer II 进行尝试。
产品优势
① 本制品是专门针对高 GC 含量模板设计的 PCR 扩增产品 DNA Polymerase、反应 buffer都经过优化,非常适合于复杂结构,富含 GC 序列或含有重复序列的基因组 DNA 和 cDNA模板扩增。
② 大部分 PCR 产物 3’端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体。
③ 扩增不同类型模板的高 GC 基因均具有良好的性能。
产品组成
组分
规格
Exp Taq DNA Polymerase (5U / μl)
25μl
2X GC buffer I
625μl x 2pc
2X GC buffer II
625μl x 2pc
dNTP Mix (10mM each)
100μl
保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋
实验示例
示例一
以 Human gDNA 为模板,分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 和 2X GC buffer II 扩增不同 GC 含量的 DNA 片段。
反应程序:
电泳结果如下图所示:
示例二
以小鼠 gDNA 为模板,分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 和 2X GC buffer II 扩增不同GC 含量的 DNA 片段。
反应程序:
电泳结果如下图所示:
示例三
以猪 gDNA 为模板,分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 和 2X GC buffer II 扩增不同 GC含量的 DNA 片段。
反应程序:
电泳结果如下图所示:
示例四
以鸡或玉米 gDNA 为模板,分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 和 2X GC buffer II 扩增不同 GC 含量的 DNA 片段。
反应程序:
电泳结果如下图所示:
示例五
以小鼠 gDNA 为模板,添加不同模板量(500ng、100ng、10ng、1ng),分别采用本试剂盒的 2X GC buffer I 扩增 1658bp DNA 片段(GC 含量 65%)和 2X GC buffer II 扩增 1166bp DNA 片段(GC 含量 70.8%),模板量低至 1ng 时,都可扩增出目的片段。
Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。
Q4:PCR 用引物的使用量
Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。
Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增
Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。
Q6:PCR 目的条带无扩增
Answer:
可能原因
建议
DNA模板
① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。 ② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构
可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段
可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。