Exp Taq PCR 试剂盒 Ver.2

¥620.00 – ¥1,100.00

货号AG11401 / AG11402
分类一般PCR系列、长片段PCR系列

产品详情

产品描述
本制品是应用 LA PCR 原理，精心优化得到的 PCR 反应体系，在本公司性能优越的 Accurate Taq enzyme 中添加了高保真酶，使其具有部分 3′-5′Exonuclease 活性（Proof reading 活性），非常适合长片段 DNA 的 PCR 扩增，且具有较好的保真性。使用本品得到的大部分 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基，可直接克隆于 T 载体。
产品优势
① Exp Taq DNA Polymerase 中添加了高保真酶，相对于 Accurate Taq 具有更高的保真性及更强的扩增能力。在普通的 PCR 扩增条件下，具有扩增效率高、错配率低的特点。
② 本产品以 λDNA 为模板可扩增出 ~40 kb 的 DNA 片段，以 Human 基因组 DNA 为模板可扩增出 ~20 kb 的 DNA 片段。
产品组成
组分 AG11401 AG11402
Exp Taq DNA Polymerase (5U / μl) 25μl 50μl
5X Exp Taq PCR Buffer Ver.2(Mg2+ plus) 500μl 1ml
dNTP Mix (10mM each) 100μl 200μl
Control Template (1ng/μl)*1 25μl 50μl
Control Primer F (10μM)*2 50μl 100μl
Control Primer R2 (10μM)*2 50μl 100μl
RNase free water 1ml x 3pc 1ml x 5pc

*1：Control Template 为 λ DNA。
*2：Control Primer F 与 Control Primer R2 搭配可以扩增 6613bp 片段。

保存与运输
保存温度：-20℃
运输温度：干冰或者 -20℃ 冰袋运输

实验示例

示例一

以 Human gDNA 为模板，采用本试剂盒扩增不同长度的 DNA 片段，能很好地扩增出 20 kb 的 DNA 片段。

0.5 kb和3.4 kb DNA 片段扩增反应程序如下：

12 kb、17.5 kb和20 kb DNA 片段扩增反应程序如下：

电泳结果如下图所示：

示例二

以 λDNA 为模板，采用本试剂盒扩增不同长度的 DNA 片段，能很好地扩增出 40 kb 的 DNA 片段。

0.5 kb、2 kb 和 6 kb 片段扩增反应程序如下：

25 kb、30 kb 和 40 kb 扩增反应程序如下：

电泳结果如下图所示：

示例三

以不同模板量（5ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg）λDNA 为模板，采用本试剂盒扩增 ~15 kb 的 DNA 片段，灵敏度可达 100fg。

反应程序如下：

电泳结果如下：

 

产品说明书

Q1：PCR 出现非特异性扩增条带

Answer:

可能原因 建议
引物浓度 引物加入量通常在 0.1 μM – 1 μM 范围内，建议按照说明书推荐量添加引物，如需要调整引物浓度，建议进行梯度调整。
引物设计 建议对设计好的引物进行特异性评估，如引物存在问题应重新设计引物，PCR 实验建议引物长度在 20 - 30 mer 左右，以增强实验特异性。
酶量 可适当减少 DNA 聚合酶的使用量。
反应程序 如果杂带比目的条带小，可适当提高退火温度，降低循环数进行优化；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。
模板 检查模板是否存在污染或降解，确认模板加入量是否在说明书推荐范围之内。

Q2：PCR 产物电泳时条带弥散

Answer:

可能原因 建议
电泳条件 可能是由于电泳时间过长或者电压不稳导致，建议检查电压，适当缩短电泳时间。
退火温度 设置梯度调整退火温度，摸索最适退火温度。
循环次数过多 可适当减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间。
酶量过高 可适当降低酶量。
引物浓度不够优化 建议对引物设置浓度梯度后进行 PCR 反应。

Q3：PCR 引物设计的一般建议

Answer: ① 引物长度通常在 20～30 nt。
② 引物GC含量在 40～60%，碱基随机分布，避开局部富含 GC 或 AT；引物之间不应有互补性，以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间，上下游引物的 GC 含量尽量保持接近，Tm 值相差一般不超过 5℃。

Q4：PCR 用引物的使用量

Answer: ① PCR 反应中，使用引物的终浓度可以在 0.1 μM～1.0 μM 之间选择，引物的浓度太低时，会导致扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整，模板添加量较多时，建议适当降低引物的浓度，当模板 DNA 的量较少时，建议提高引物的浓度。

Q5：如何避免 PCR 出现假阳性扩增

Answer: ① 进行 PCR 实验时，建议划分独立的实验区域，配制 PCR 反应体系时做好防污染工作，避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照，以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。

Q6：PCR 目的条带无扩增

Answer:

可能原因 建议
DNA模板 ① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测（cDNA 模板不建议测浓度），并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性，如 DNA 模板为粗提模板，可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。
② 若模板 DNA 浓度太低，应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构 可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒；适当增加变性时间或温度 ，高效解离双链 DNA 模板。
长片段 可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶；适当降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性；根据扩增片段长度，增加延伸时间。
引物 检查引物设计是否合理，确保引物针对目的片段具有特异性；可将引物分装保存，防止多次冻融或长期 4℃ 保存，导致引物降解失效；优化引物使用量。
酶 可更换新酶验证酶是否失活或活性降低导致目的条带无扩增。
Mg2+ 浓度 若有需要可适当调整 Buffer 体系中的 Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度过高会降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增效率。
反应程序 优化 DNA 模板变性时间和温度（如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活；温度过低则模板变性不彻底）；可对退火温度设置梯度，摸索最佳的退火温度；选择适合于目的片段长度的延伸时间。

Q7：标注 dye plus 的染料有什么作用？如果需要对产物进行回收会影响产物质量吗？

Answer: 使用艾科瑞生物所有标注（dye plus）的 PCR 试剂是指反应体系中已添加电泳检测时所需的染料试剂，PCR 产物进行电泳时无需额外添加 loading buffer ，完成反应后可直接点样进行凝胶电泳；染料仅用于指示电泳进行的程度，带染料的 PCR 产物不会影响回收产物的质量。

Q8：PCR 系列产品的产物是否带 A 尾

Answer: 使用 Accurate Taq、Pro Taq、Exp Taq 系列产品得到的 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基，可直接克隆于 T 载体；使用高保真 PCR、快速 PCR 以及直扩 PCR 系列产品得到的产物是平末端，不可直接进行 T 载连接，可在反应产物中加入少量 Taq 酶，72℃ 反应 30 ~ 40 min，即可为产物加上 A 尾。

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