本制品是应用 LA PCR 原理,精心优化得到的 PCR 反应体系,在本公司性能优越的 Accurate Taq enzyme 中添加了高保真酶,使其具有部分 3′-5′Exonuclease 活性(Proof reading 活性),非常适合长片段 DNA 的 PCR 扩增,且具有较好的保真性。使用本品得到的大部分 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体。
产品优势
① Exp Taq DNA Polymerase 中添加了高保真酶,相对于 Accurate Taq 具有更高的保真性及更强的扩增能力。在普通的 PCR 扩增条件下,具有扩增效率高、错配率低的特点。
② 本产品以 λDNA 为模板可扩增出 ~40 kb 的 DNA 片段,以 Human 基因组 DNA 为模板可扩增出 ~20 kb 的 DNA 片段。
产品组成
组分
AG11401
AG11402
Exp Taq DNA Polymerase (5U / μl)
25μl
50μl
5X Exp Taq PCR Buffer Ver.2(Mg2+ plus)
500μl
1ml
dNTP Mix (10mM each)
100μl
200μl
Control Template (1ng/μl)*1
25μl
50μl
Control Primer F (10μM)*2
50μl
100μl
Control Primer R2 (10μM)*2
50μl
100μl
RNase free water
1ml x 3pc
1ml x 5pc
*1:Control Template 为 λ DNA。
*2:Control Primer F 与 Control Primer R2 搭配可以扩增 6613bp 片段。
保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋运输
实验示例
示例一
以 Human gDNA 为模板,采用本试剂盒扩增不同长度的 DNA 片段,能很好地扩增出 20 kb 的 DNA 片段。
0.5 kb和3.4 kb DNA 片段扩增反应程序如下:
12 kb、17.5 kb和20 kb DNA 片段扩增反应程序如下:
电泳结果如下图所示:
示例二
以 λDNA 为模板,采用本试剂盒扩增不同长度的 DNA 片段,能很好地扩增出 40 kb 的 DNA 片段。
0.5 kb、2 kb 和 6 kb 片段扩增反应程序如下:
25 kb、30 kb 和 40 kb 扩增反应程序如下:
电泳结果如下图所示:
示例三
以不同模板量(5ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg)λDNA 为模板,采用本试剂盒扩增 ~15 kb 的 DNA 片段,灵敏度可达 100fg。
Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。
Q4:PCR 用引物的使用量
Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。
Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增
Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。
Q6:PCR 目的条带无扩增
Answer:
可能原因
建议
DNA模板
① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。 ② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构
可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段
可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。