产品详情
组分 | 规格 |
Accurate Taq DNA Polymerase (5U / μl) | 50μl |
10X Taq PCR Buffer (Mg2+ free) | 1ml |
dNTP Mix (10mM each) | 200μl |
MgCl2 Solution (50mM) | 500μl |
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋
组分 | 规格 |
Accurate Taq DNA Polymerase (5U / μl) | 50μl |
10X Taq PCR Buffer (Mg2+ free) | 1ml |
dNTP Mix (10mM each) | 200μl |
MgCl2 Solution (50mM) | 500μl |
Answer:
可能原因 | 建议 |
引物浓度 | 引物加入量通常在 0.1 μM – 1 μM 范围内,建议按照说明书推荐量添加引物,如需要调整引物浓度,建议进行梯度调整。 |
引物设计 | 建议对设计好的引物进行特异性评估,如引物存在问题应重新设计引物,PCR 实验建议引物长度在 20 - 30 mer 左右,以增强实验特异性。 |
酶量 | 可适当减少 DNA 聚合酶的使用量。 |
反应程序 | 如果杂带比目的条带小,可适当提高退火温度,降低循环数进行优化;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。 |
模板 | 检查模板是否存在污染或降解,确认模板加入量是否在说明书推荐范围之内。 |
Answer:
可能原因 | 建议 |
电泳条件 | 可能是由于电泳时间过长或者电压不稳导致,建议检查电压,适当缩短电泳时间。 |
退火温度 | 设置梯度调整退火温度,摸索最适退火温度。 |
循环次数过多 | 可适当减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间。 |
酶量过高 | 可适当降低酶量。 |
引物浓度不够优化 | 建议对引物设置浓度梯度后进行 PCR 反应。 |
Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。
Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。
Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。
Answer:
可能原因 | 建议 |
DNA模板 | ① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。 ② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。 |
目的片段 GC 含量高或富含二级结构 | 可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。 |
长片段 | 可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。 |
引物 | 检查引物设计是否合理,确保引物针对目的片段具有特异性;可将引物分装保存,防止多次冻融或长期 4℃ 保存,导致引物降解失效;优化引物使用量。 |
酶 | 可更换新酶验证酶是否失活或活性降低导致目的条带无扩增。 |
Mg2+ 浓度 | 若有需要可适当调整 Buffer 体系中的 Mg2+ 浓度,Mg2+ 浓度过高会降低 PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增效率。 |
反应程序 | 优化 DNA 模板变性时间和温度(如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活;温度过低则模板变性不彻底);可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度;选择适合于目的片段长度的延伸时间。 |
Answer: 使用艾科瑞生物所有标注(dye plus)的 PCR 试剂是指反应体系中已添加电泳检测时所需的染料试剂,PCR 产物进行电泳时无需额外添加 loading buffer ,完成反应后可直接点样进行凝胶电泳;染料仅用于指示电泳进行的程度,带染料的 PCR 产物不会影响回收产物的质量。
Answer: 使用 Accurate Taq、Pro Taq、Exp Taq 系列产品得到的 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体;使用高保真 PCR、快速 PCR 以及直扩 PCR 系列产品得到的产物是平末端,不可直接进行 T 载连接,可在反应产物中加入少量 Taq 酶,72℃ 反应 30 ~ 40 min,即可为产物加上 A 尾。