AdeptTect 快速 HS PCR 预混液(含染料)

¥150.00

货号AG12301
分类一般PCR系列、快速扩增PCR系列

产品详情

产品描述

AdeptTect Flash HS PCR Master Mix ( dye plus ) 是适用于快速 PCR 反应的 2 倍浓度预混型制品,具有超快的延伸速度(可达 5sec/kb );同时,本制品还具有高扩增效率、高灵敏度、高特异性、高退火效率等特点。本制品中含有电泳所必需的色素试剂(蓝色和黄色色素),制品溶液呈现鲜艳的绿色;使用本制品时,只需要在溶液中加入模板、引物和水便可以进行 PCR 反应;PCR 反应后可直接进行电泳,操作便捷,可最大限度地减少人为误差,并在较短时间内即可获得检测结果。此外,本制品中还添加了在常温状态下能够抑制 DNA Polymerase 活性的单克隆抗体,可以进行 Hot Start PCR,有效抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。
本制品扩增得到的产物 3’ 端不含 A 碱基,因此不可用于 TA 克隆。

产品优势

① 本制品具有高扩增效率、高灵敏度、高特异性、高退火效率及延伸速度快等特点,可提高 PCR 扩增效率。
② 本制品具有超快的延伸速度(可达 5sec/kb )。
③ 本制品为 2X 预混液,加入模板、引物和水即可进行 PCR 反应,操作简便,可最大限度地减少人为误差。
④ 本制品含有电泳所必需的色素试剂(蓝色和黄色色素),PCR 反应后可以直接进行电泳,在较短时间内即可获得检测结果。

产品组成
组分 规格
2X Flash HS PCR Master Mix ( dye plus ) 500μl x 6pc
保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

以 Human gDNA 为模板,采用本试剂盒以不同的延伸速度扩增不同长度的 DNA 片段,能以 10sec 的延伸时间扩增出 4kb DNA 片段。

反应程序(理论时长12.5min) :

电泳结果如下图所示:

示例二

以 Human Total RNA 反转录获得的 cDNA 为模板,扩增不同长度的 DNA 片段。

4kb DNA 片段的反应程序(理论时长16min):

10kb DNA 片段的反应程序(理论时长56min):

13kb DNA 片段的反应程序(理论时长68.5min):

电泳结果如下图所示:

示例三

挑取 E.coli 单菌落加入至 20μl RNase free water 中,混匀后取 1μl 菌液为模板,扩增不同长度的 DNA 片段,能以 3sec/kb 扩增出 7kb DNA 片段。

反应程序:

电泳结果如下图所示:

 

示例四

以 Human gDNA 为模板,添加不同模板量(500ng、300ng、100ng、10ng、1ng、100pg),采用本试剂盒扩增 4kb DNA 片段,模板量低至 1ng 时,能以 5sec/kb 的延伸速度扩增出目的片段。

反应程序(理论时长17.5min):

电泳结果如下图所示:

 

示例五

以 λDNA 为模板,添加不同模板量(5ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg),采用本试剂盒扩增 4kb DNA 片段,模板量低至 100fg 时,能以 5sec/kb 的延伸速度扩增出目的片段。

反应程序(理论时长17.5min):

电泳结果如下图所示:

 

示例六

以 Human gDNA(泳道1~2)为模板,可扩增 17.5 kb 的 DNA 片段;以 λDNA(泳道3~6)为模板,能够很好地扩增 40 kb 的 DNA 片段。

反应程序 :

电泳结果如下图所示:

实验例表
模板类型 扩增速度 片段大小(kb) 序列GC含量 模板提取方式 模板量 能否扩增
Human gDNA 30 sec /kb 0.5 kb 75.4% 试剂法 100 ng
Human gDNA 5 sec /kb 1 kb 36.1% 试剂法 100 ng
Human gDNA 5 sec /kb 2 kb 38.1% 试剂法 100 ng
Human gDNA 1 min/kb 2.1 kb 26.9% 试剂法 100 ng
Human gDNA 4 sec /kb 3 kb 38.7% 试剂法 100 ng
Human gDNA 2.5 sec /kb 4 kb 36.0% 试剂法 100 ng
Human gDNA 10 sec /kb 6 kb 40.0% 试剂法 100 ng
Human gDNA 15 sec /kb 7.5 kb 37.1% 试剂法 100 ng
Human gDNA 15 sec /kb 10 kb 37.7% 试剂法 100 ng
Human gDNA 15 sec /kb 12 kb 40.0% 试剂法 100 ng
Human gDNA 15 sec /kb 17.5 kb 37.4% 试剂法 100 ng
Mouse  gDNA 5 sec /kb 1 kb 52.2% 磁珠法 100 ng
Mouse  gDNA 5 sec /kb 2.6 kb 65.2% 磁珠法 100 ng
Mouse  gDNA 5 sec /kb 3.4 kb 53.4% 磁珠法 100 ng
Mouse  gDNA 5 sec /kb 4 kb 49.8% 磁珠法 100 ng
Mouse  gDNA 15 sec /kb 5 kb 49.8% 磁珠法 100 ng
Mouse  gDNA 15 sec /kb 11 kb 51.6% 磁珠法 100 ng
Chicken  gDNA 5 sec /kb 0.5 kb 41.0% 磁珠法 74 ng
Chicken  gDNA 5 sec /kb 1.2 kb 36.6% 磁珠法 74 ng
Chicken  gDNA 5 sec /kb 1.7 kb 68.6% 磁珠法 74 ng
Chicken  gDNA 5 sec /kb 2.4 kb 49.4% 磁珠法 74 ng
Pig gDNA 5 sec /kb 0.6 kb 47.6% 磁珠法 30 ng
Pig gDNA 5 sec /kb 0.8 kb 50.2% 磁珠法 30 ng
Pig gDNA 5 sec /kb 2 kb 57.9% 磁珠法 30 ng
Pig gDNA 5 sec /kb 2.9 kb 37.7% 磁珠法 30 ng
Pig gDNA 10 sec /kb 6 kb 59.3% 磁珠法 30 ng
Potato gDNA 5 sec /kb 1.3 kb 39.5% 柱式法 50 ng
Potato gDNA 5 sec /kb 2 kb 39.6% 柱式法 50 ng
Potato gDNA 5 sec /kb 2.9 kb 38.2% 柱式法 50 ng
Potato gDNA 10 sec /kb 5.8 kb 35.4% 柱式法 50 ng
Potato gDNA 10 sec /kb 10 kb 38.0% 柱式法 50 ng
Tomato gDNA 5 sec /kb 0.5 kb 28.2% 磁珠法/柱式法 120 ng
Tomato gDNA 5 sec /kb 1.6 kb 32.2% 磁珠法/柱式法 120 ng
Tomato gDNA 5 sec /kb 1.9 kb 36.0% 磁珠法/柱式法 120 ng
Tomato gDNA 5 sec /kb 3 kb 37.4% 磁珠法/柱式法 120 ng
Tomato gDNA 5 sec /kb 4.4 kb 37.6% 磁珠法/柱式法 120 ng
Tomato gDNA 5 sec /kb 5 kb 38.2% 磁珠法/柱式法 120 ng
Rice gDNA 5 sec /kb 1 kb 45.6% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng
Rice gDNA 5 sec /kb 3 kb 41.5% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng
Rice gDNA 5 sec /kb 5 kb 40.5% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng
Rice gDNA 10 sec /kb 7.5 kb 46.8% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng
Rice gDNA 10 sec /kb 12 kb 44.6% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng
λDNA 20 sec /kb 30 kb 51.1% 2 ng
大肠杆菌菌落 5 sec /kb 1 kb 53.8% / 单菌落
大肠杆菌菌落 5 sec /kb 2 kb 51.1% / 单菌落
大肠杆菌菌落 5 sec /kb 3.5 kb 52.2% / 单菌落
大肠杆菌菌落 5 sec /kb 5 kb 53.2% / 单菌落
大肠杆菌菌落 10 sec /kb 6.7 kb 51.8% / 单菌落
大肠杆菌菌落 10 sec /kb 11 kb 50.7% / 单菌落

注:√表示能够扩增,/表示未提取。-表示直接购买。

产品说明书

Q1:PCR 出现非特异性扩增条带

Answer:

可能原因 建议
引物浓度 引物加入量通常在 0.1 μM – 1 μM 范围内,建议按照说明书推荐量添加引物,如需要调整引物浓度,建议进行梯度调整。
引物设计 建议对设计好的引物进行特异性评估,如引物存在问题应重新设计引物,PCR 实验建议引物长度在 20 - 30 mer 左右,以增强实验特异性。
酶量 可适当减少 DNA 聚合酶的使用量。
反应程序 如果杂带比目的条带小,可适当提高退火温度,降低循环数进行优化;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。
模板 检查模板是否存在污染或降解,确认模板加入量是否在说明书推荐范围之内。

Q2:PCR 产物电泳时条带弥散

Answer:

可能原因 建议
电泳条件 可能是由于电泳时间过长或者电压不稳导致,建议检查电压,适当缩短电泳时间。
退火温度 设置梯度调整退火温度,摸索最适退火温度。
循环次数过多 可适当减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间。
酶量过高 可适当降低酶量。
引物浓度不够优化 建议对引物设置浓度梯度后进行 PCR 反应。

Q3:PCR 引物设计的一般建议

Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。

Q4:PCR 用引物的使用量

Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。

Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增

Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。

Q6:PCR 目的条带无扩增

Answer:

可能原因 建议
DNA模板 ① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。
② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构 可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段 可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。
引物 检查引物设计是否合理,确保引物针对目的片段具有特异性;可将引物分装保存,防止多次冻融或长期 4℃ 保存,导致引物降解失效;优化引物使用量。
可更换新酶验证酶是否失活或活性降低导致目的条带无扩增。
Mg2+ 浓度 若有需要可适当调整 Buffer 体系中的 Mg2+ 浓度,Mg2+ 浓度过高会降低 PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增效率。
反应程序 优化 DNA 模板变性时间和温度(如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活;温度过低则模板变性不彻底);可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度;选择适合于目的片段长度的延伸时间。

Q7:标注 dye plus 的染料有什么作用?如果需要对产物进行回收会影响产物质量吗?

Answer: 使用艾科瑞生物所有标注(dye plus)的 PCR 试剂是指反应体系中已添加电泳检测时所需的染料试剂,PCR 产物进行电泳时无需额外添加 loading buffer ,完成反应后可直接点样进行凝胶电泳;染料仅用于指示电泳进行的程度,带染料的 PCR 产物不会影响回收产物的质量。

Q8:PCR 系列产品的产物是否带 A 尾

Answer: 使用 Accurate TaqPro TaqExp Taq 系列产品得到的 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体;使用高保真 PCR、快速 PCR 以及直扩 PCR 系列产品得到的产物是平末端,不可直接进行 T 载连接,可在反应产物中加入少量 Taq 酶,72℃ 反应 30 ~ 40 min,即可为产物加上 A 尾。

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