AdeptTect 快速 HS PCR 预混液（含染料）

¥150.00

货号AG12301
分类一般PCR系列、快速扩增PCR系列

产品详情

产品描述

AdeptTect Flash HS PCR Master Mix ( dye plus ) 是适用于快速 PCR 反应的 2 倍浓度预混型制品，具有超快的延伸速度（可达 5sec/kb ）；同时，本制品还具有高扩增效率、高灵敏度、高特异性、高退火效率等特点。本制品中含有电泳所必需的色素试剂（蓝色和黄色色素），制品溶液呈现鲜艳的绿色；使用本制品时，只需要在溶液中加入模板、引物和水便可以进行 PCR 反应；PCR 反应后可直接进行电泳，操作便捷，可最大限度地减少人为误差，并在较短时间内即可获得检测结果。此外，本制品中还添加了在常温状态下能够抑制 DNA Polymerase 活性的单克隆抗体，可以进行 Hot Start PCR，有效抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。
本制品扩增得到的产物 3’ 端不含 A 碱基，因此不可用于 TA 克隆。

产品优势

① 本制品具有高扩增效率、高灵敏度、高特异性、高退火效率及延伸速度快等特点，可提高 PCR 扩增效率。
② 本制品具有超快的延伸速度（可达 5sec/kb ）。
③ 本制品为 2X 预混液，加入模板、引物和水即可进行 PCR 反应，操作简便，可最大限度地减少人为误差。
④ 本制品含有电泳所必需的色素试剂（蓝色和黄色色素），PCR 反应后可以直接进行电泳，在较短时间内即可获得检测结果。

产品组成
组分 规格
2X Flash HS PCR Master Mix ( dye plus ) 500μl x 6pc
保存与运输
保存温度：-20℃
运输温度：干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

以 Human gDNA 为模板，采用本试剂盒以不同的延伸速度扩增不同长度的 DNA 片段，能以 10sec 的延伸时间扩增出 4kb DNA 片段。

反应程序（理论时长12.5min） ：

电泳结果如下图所示：

示例二

以 Human Total RNA 反转录获得的 cDNA 为模板，扩增不同长度的 DNA 片段。

4kb DNA 片段的反应程序（理论时长16min）：

10kb DNA 片段的反应程序（理论时长56min）：

13kb DNA 片段的反应程序（理论时长68.5min）：

电泳结果如下图所示：

示例三

挑取 E.coli 单菌落加入至 20μl RNase free water 中，混匀后取 1μl 菌液为模板，扩增不同长度的 DNA 片段，能以 3sec/kb 扩增出 7kb DNA 片段。

反应程序:

电泳结果如下图所示：

 

示例四

以 Human gDNA 为模板，添加不同模板量（500ng、300ng、100ng、10ng、1ng、100pg），采用本试剂盒扩增 4kb DNA 片段，模板量低至 1ng 时，能以 5sec/kb 的延伸速度扩增出目的片段。

反应程序（理论时长17.5min）:

电泳结果如下图所示：

 

示例五

以 λDNA 为模板，添加不同模板量（5ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg），采用本试剂盒扩增 4kb DNA 片段，模板量低至 100fg 时，能以 5sec/kb 的延伸速度扩增出目的片段。

反应程序（理论时长17.5min）:

电泳结果如下图所示：

 

示例六

以 Human gDNA（泳道1~2）为模板，可扩增 17.5 kb 的 DNA 片段；以 λDNA（泳道3~6）为模板，能够很好地扩增 40 kb 的 DNA 片段。

反应程序 :

电泳结果如下图所示：

实验例表
模板类型 扩增速度 片段大小（kb） 序列GC含量 模板提取方式 模板量 能否扩增
Human gDNA 30 sec /kb 0.5 kb 75.4% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 5 sec /kb 1 kb 36.1% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 5 sec /kb 2 kb 38.1% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 1 min/kb 2.1 kb 26.9% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 4 sec /kb 3 kb 38.7% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 2.5 sec /kb 4 kb 36.0% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 10 sec /kb 6 kb 40.0% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 15 sec /kb 7.5 kb 37.1% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 15 sec /kb 10 kb 37.7% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 15 sec /kb 12 kb 40.0% 试剂法 100 ng √
Human gDNA 15 sec /kb 17.5 kb 37.4% 试剂法 100 ng √
Mouse  gDNA 5 sec /kb 1 kb 52.2% 磁珠法 100 ng √
Mouse  gDNA 5 sec /kb 2.6 kb 65.2% 磁珠法 100 ng √
Mouse  gDNA 5 sec /kb 3.4 kb 53.4% 磁珠法 100 ng √
Mouse  gDNA 5 sec /kb 4 kb 49.8% 磁珠法 100 ng √
Mouse  gDNA 15 sec /kb 5 kb 49.8% 磁珠法 100 ng √
Mouse  gDNA 15 sec /kb 11 kb 51.6% 磁珠法 100 ng √
Chicken  gDNA 5 sec /kb 0.5 kb 41.0% 磁珠法 74 ng √
Chicken  gDNA 5 sec /kb 1.2 kb 36.6% 磁珠法 74 ng √
Chicken  gDNA 5 sec /kb 1.7 kb 68.6% 磁珠法 74 ng √
Chicken  gDNA 5 sec /kb 2.4 kb 49.4% 磁珠法 74 ng √
Pig gDNA 5 sec /kb 0.6 kb 47.6% 磁珠法 30 ng √
Pig gDNA 5 sec /kb 0.8 kb 50.2% 磁珠法 30 ng √
Pig gDNA 5 sec /kb 2 kb 57.9% 磁珠法 30 ng √
Pig gDNA 5 sec /kb 2.9 kb 37.7% 磁珠法 30 ng √
Pig gDNA 10 sec /kb 6 kb 59.3% 磁珠法 30 ng √
Potato gDNA 5 sec /kb 1.3 kb 39.5% 柱式法 50 ng √
Potato gDNA 5 sec /kb 2 kb 39.6% 柱式法 50 ng √
Potato gDNA 5 sec /kb 2.9 kb 38.2% 柱式法 50 ng √
Potato gDNA 10 sec /kb 5.8 kb 35.4% 柱式法 50 ng √
Potato gDNA 10 sec /kb 10 kb 38.0% 柱式法 50 ng √
Tomato gDNA 5 sec /kb 0.5 kb 28.2% 磁珠法/柱式法 120 ng √
Tomato gDNA 5 sec /kb 1.6 kb 32.2% 磁珠法/柱式法 120 ng √
Tomato gDNA 5 sec /kb 1.9 kb 36.0% 磁珠法/柱式法 120 ng √
Tomato gDNA 5 sec /kb 3 kb 37.4% 磁珠法/柱式法 120 ng √
Tomato gDNA 5 sec /kb 4.4 kb 37.6% 磁珠法/柱式法 120 ng √
Tomato gDNA 5 sec /kb 5 kb 38.2% 磁珠法/柱式法 120 ng √
Rice gDNA 5 sec /kb 1 kb 45.6% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng √
Rice gDNA 5 sec /kb 3 kb 41.5% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng √
Rice gDNA 5 sec /kb 5 kb 40.5% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng √
Rice gDNA 10 sec /kb 7.5 kb 46.8% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng √
Rice gDNA 10 sec /kb 12 kb 44.6% 磁珠法/柱式法 100 ng/200 ng √
λDNA 20 sec /kb 30 kb 51.1% – 2 ng √
大肠杆菌菌落 5 sec /kb 1 kb 53.8% / 单菌落 √
大肠杆菌菌落 5 sec /kb 2 kb 51.1% / 单菌落 √
大肠杆菌菌落 5 sec /kb 3.5 kb 52.2% / 单菌落 √
大肠杆菌菌落 5 sec /kb 5 kb 53.2% / 单菌落 √
大肠杆菌菌落 10 sec /kb 6.7 kb 51.8% / 单菌落 √
大肠杆菌菌落 10 sec /kb 11 kb 50.7% / 单菌落 √

注：√表示能够扩增，/表示未提取。-表示直接购买。

产品说明书

Q1：PCR 出现非特异性扩增条带

Answer:

可能原因 建议
引物浓度 引物加入量通常在 0.1 μM – 1 μM 范围内，建议按照说明书推荐量添加引物，如需要调整引物浓度，建议进行梯度调整。
引物设计 建议对设计好的引物进行特异性评估，如引物存在问题应重新设计引物，PCR 实验建议引物长度在 20 - 30 mer 左右，以增强实验特异性。
酶量 可适当减少 DNA 聚合酶的使用量。
反应程序 如果杂带比目的条带小，可适当提高退火温度，降低循环数进行优化；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数。
模板 检查模板是否存在污染或降解，确认模板加入量是否在说明书推荐范围之内。

Q2：PCR 产物电泳时条带弥散

Answer:

可能原因 建议
电泳条件 可能是由于电泳时间过长或者电压不稳导致，建议检查电压，适当缩短电泳时间。
退火温度 设置梯度调整退火温度，摸索最适退火温度。
循环次数过多 可适当减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间。
酶量过高 可适当降低酶量。
引物浓度不够优化 建议对引物设置浓度梯度后进行 PCR 反应。

Q3：PCR 引物设计的一般建议

Answer: ① 引物长度通常在 20～30 nt。
② 引物GC含量在 40～60%，碱基随机分布，避开局部富含 GC 或 AT；引物之间不应有互补性，以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间，上下游引物的 GC 含量尽量保持接近，Tm 值相差一般不超过 5℃。

Q4：PCR 用引物的使用量

Answer: ① PCR 反应中，使用引物的终浓度可以在 0.1 μM～1.0 μM 之间选择，引物的浓度太低时，会导致扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整，模板添加量较多时，建议适当降低引物的浓度，当模板 DNA 的量较少时，建议提高引物的浓度。

Q5：如何避免 PCR 出现假阳性扩增

Answer: ① 进行 PCR 实验时，建议划分独立的实验区域，配制 PCR 反应体系时做好防污染工作，避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照，以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。

Q6：PCR 目的条带无扩增

Answer:

可能原因 建议
DNA模板 ① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测（cDNA 模板不建议测浓度），并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性，如 DNA 模板为粗提模板，可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。
② 若模板 DNA 浓度太低，应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构 可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒；适当增加变性时间或温度 ，高效解离双链 DNA 模板。
长片段 可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶；适当降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性；根据扩增片段长度，增加延伸时间。
引物 检查引物设计是否合理，确保引物针对目的片段具有特异性；可将引物分装保存，防止多次冻融或长期 4℃ 保存，导致引物降解失效；优化引物使用量。
酶 可更换新酶验证酶是否失活或活性降低导致目的条带无扩增。
Mg2+ 浓度 若有需要可适当调整 Buffer 体系中的 Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度过高会降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增效率。
反应程序 优化 DNA 模板变性时间和温度（如果温度过高，酶在前几个循环就迅速失活；温度过低则模板变性不彻底）；可对退火温度设置梯度，摸索最佳的退火温度；选择适合于目的片段长度的延伸时间。

Q7：标注 dye plus 的染料有什么作用？如果需要对产物进行回收会影响产物质量吗？

Answer: 使用艾科瑞生物所有标注（dye plus）的 PCR 试剂是指反应体系中已添加电泳检测时所需的染料试剂，PCR 产物进行电泳时无需额外添加 loading buffer ，完成反应后可直接点样进行凝胶电泳；染料仅用于指示电泳进行的程度，带染料的 PCR 产物不会影响回收产物的质量。

Q8：PCR 系列产品的产物是否带 A 尾

Answer: 使用 Accurate Taq、Pro Taq、Exp Taq 系列产品得到的 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基，可直接克隆于 T 载体；使用高保真 PCR、快速 PCR 以及直扩 PCR 系列产品得到的产物是平末端，不可直接进行 T 载连接，可在反应产物中加入少量 Taq 酶，72℃ 反应 30 ~ 40 min，即可为产物加上 A 尾。

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