本制品是在本公司性能优越的 Accurate Taq enzyme 中添加了高保真酶,使其具有部分 3′-5′ Exonuclease 活性 (Proof reading活性),精心优化得到的 PCR 反应体系,非常适合长片段 DNA 的 PCR 扩增。
同时在 Exp Taq HS DNA Polymerase 中还混合了 Taq 单克隆抗体,可以进行 Hot Start PCR。反应开始前抗体会与 Taq 酶结合并抑制其活性,从而可以抑制低温条件下引物非特异性退火引起的非特异性扩增。当 PCR 反应开始后,抗体会在最初的 DNA 变性步骤中失活,因此在常规 PCR 反应条件下即可使用。使用本品得到的大部分 PCR 产物 3’ 端带有一个 A 碱基,可直接克隆于 T 载体。
产品优势
① 本制品是精心优化得到的 PCR 反应体系,非常适合长片段和较复杂 DNA 的 PCR 扩增。以 λDNA 为模板可扩增 ~40 kb 的 DNA 片段,以 Human 基因组 DNA 为模板可扩增 ~20 kb 的 DNA 片段。
② Exp Taq HS DNA Polymerase 中添加了高保真酶,相对于 Accurate Taq 具有更高的保真性及更强的扩增能力。在普通的 PCR 扩增条件下,具有扩增效率高、错配率低的特点。
③ Exp Taq HS DNA Polymerase 中添加了能够抑制 DNA polymerase 活性的单克隆抗体,可以进行热启动反应。在进行 PCR 反应前,抗体与酶结合抑制 DNA 聚合酶的活性,有效抑制引物二聚体的形成及非特异性扩增。
产品组成
组分
AG11501
AG11502
Exp Taq HS DNA Polymerase (5U / μl)
25μl
100μl
5X Exp Taq PCR Buffer Ver.2 (Mg2+ plus)
500μl
1ml x 2pc
dNTP Mix (10mM each)
100μl
400μl
保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋运输
实验示例
示例一
以 Human gDNA 为模板,采用本试剂盒扩增不同长度的 DNA 片段,能很好地扩增出 20 kb 的 DNA 片段。
0.5 kb和3.4 kb DNA 片段扩增反应程序如下:
12 kb、17.5 kb和20 kb DNA 片段扩增反应程序如下:
电泳结果如下图所示:
示例二
以 λDNA 为模板,采用本试剂盒扩增不同长度的 DNA 片段,能很好地扩增出 40 kb 的 DNA 片段。
2 kb 和12 kb DNA 片段扩增反应程序如下:
15 kb、25 kb、30 kb和40 kb扩增反应程序如下:
电泳结果如下图所示:
示例三
以不同模板量(5ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg)的 λDNA 为模板,采用本试剂盒扩增 ~15 kb 的 DNA 片段,灵敏度可达 100fg。
Answer: ① 引物长度通常在 20~30 nt。
② 引物GC含量在 40~60%,碱基随机分布,避开局部富含 GC 或 AT;引物之间不应有互补性,以防引物二聚体的形成。
③ 引物的Tm值在 55 - 70℃ 之间,上下游引物的 GC 含量尽量保持接近,Tm 值相差一般不超过 5℃。
Q4:PCR 用引物的使用量
Answer: ① PCR 反应中,使用引物的终浓度可以在 0.1 μM~1.0 μM 之间选择,引物的浓度太低时,会导致扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。
② 引物的浓度也需要根据加入模板 DNA 的量进行适当调整,模板添加量较多时,建议适当降低引物的浓度,当模板 DNA 的量较少时,建议提高引物的浓度。
Q5:如何避免 PCR 出现假阳性扩增
Answer: ① 进行 PCR 实验时,建议划分独立的实验区域,配制 PCR 反应体系时做好防污染工作,避免出现污染导致假阳性扩增。
② 为了避免出现交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将模板吸入加样枪内或溅出离心管外。
③ 建议在进行 PCR 实验时设立适当的阳性对照和阴性对照,以便对出现异常结果的原因进行判断、排查。
Q6:PCR 目的条带无扩增
Answer:
可能原因
建议
DNA模板
① 应对模板 DNA 的浓度和纯度进行检测(cDNA 模板不建议测浓度),并通过凝胶电泳检测模板 DNA 完整性,如 DNA 模板为粗提模板,可选择抗抑制能力强的具有针对性的 PCR 试剂盒。 ② 若模板 DNA 浓度太低,应适当增加起始量或 PCR 循环数。
目的片段 GC 含量高或富含二级结构
可选择针对高 GC 含量扩增的 PCR 试剂盒;适当增加变性时间或温度 ,高效解离双链 DNA 模板。
长片段
可使用适合长片段 PCR 扩增的 DNA 聚合酶;适当降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性;根据扩增片段长度,增加延伸时间。