40X Dilution Buffer（Yellow）

Answer: 若基因表达量不是太低，通常建议将 cDNA 进行稀释。稀释倍数应根据目的基因的表达量情况来决定，可进行预实验，构建一系列浓度梯度的 cDNA 模板，选择 CT 值落在 15 - 35 范围内的稀释倍数即可。
（如使用 cDNA 原液进行检测的时候，cDNA 原液使用体积不要超过定量 PCR 反应总体积的 10%。）

Answer: ROX Reference Dye 可用于定量 PCR 过程中孔间荧光信号校准，是否添加 ROX 应根据 qPCR 仪器型号决定（可参考下图）。艾科瑞生物提供 2 种浓度的 ROX 染料溶液，也提供预混了不同浓度 ROX Reference Dye 的染料法荧光定量试剂盒，能够有效地减少单加或漏加 ROX 带来的实验误差。

Answer: ① 加样体积不准确：移液枪可能不准，应定期校准移液枪；应现将引物、试剂和水配制成预混液再进行分装，以减少加样误差。
② 模板浓度过低：当反应体系中模板浓度过低时，CT 会很大，通常 35 以上的 CT 值结果会不稳定，不具有参考性。

Answer: ① 引物二聚体：可配合熔解曲线分析，若 NTC 的熔解曲线和目的基因熔解曲线峰不重叠（Tm 通常在 80℃ 之前），则为引物二聚体峰。NTC 中没有模板，引物溶液容易自身结合形成二聚体，当加入模板后，模板优先结合引物，二聚体消失，则该实验结果可用。
② 模板污染：若 NTC 的熔解曲线峰和目的基因熔解曲线峰重叠，则为模板污染。可分别对实验 NTC 所用的无酶水、试剂、引物等进行更换，以排除污染来源。