miRNA cDNA 第一链合成试剂盒

¥980.00¥2,980.00

货号AG11716 / AG11717
分类反转录系列、miRNA反转录试剂

产品详情

产品描述

本制品是应用加 A 尾法进行 miRNA 第一链 cDNA 合成的试剂盒。先使用 Poly ( A ) Polymerase 在 miRNA 3’末端加 A 尾,再使用通用反转录引物(带有特定标签的 Oligo dT引物)进行反转录反应,最终生成 miRNA 的第一链 cDNA。该制品中 miRNA RT Enzyme Mix 包含加 A 尾酶和反转录酶,2X miRNA RT Reaction Solution 含有通用反转录引物,经过优化,在同一反应体系中同时高效的完成加 A 尾和反转录反应,简化了实验操作流程,可减少试剂损失及实验误差。本制品适用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 样品的反转录。
本制品包含后续 qPCR 检测所需引物 miRNA qPCR 3’primer。

产品优势

① 本试剂盒将 miRNA 的加 A 尾反应和逆转录反应合二为一,使用方便,可减少实验误差,提高低丰度 miRNA 的检出率。
② 本试剂盒可对 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的样品进行反转录。

产品组成
组分 AG11716 AG11717
miRNA RT Enzyme Mix*1 12.5μl 62.5μl
2X miRNA RT Reaction Solution*2 50μl 250μl
miRNA qPCR 3’primer (10μM)*3 250μl 625μl x 2pc
RNase free water 1ml 1ml

*1:含有Poly(A) Polymerase、M-MLV RTase、RNase Inhibitor;
*2:含有通用反转录引物;
*3:用于qPCR反应,Tm 值为 59℃。

保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

以合成的 miRNA hsa-miR-571 ( RNA 拷贝数分别是 5*107 ~ 5*101 copies) 为模板,采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA,并以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测。结果如下所示:

结果如上图:
① 工作曲线 R2=0.9997,扩增效率 90.3%。
② 可以在宽广的模板范围内进行准确的定量,5*107~5*101 copies RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰,扩增特异性强。

示例二

以土豆 Total RNA ( RNA 量是 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg )为模板,采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA,将得到的 cDNA 稀释 10 倍后,以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA stu-miR3903p。结果如下所示:

结果如上图:
① 工作曲线 R2=0.9977,扩增效率 105.8%。
② 在 2μg ~ 200 pg RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰,扩增特异性强。

示例三

以 HL60 Total RNA ( RNA 量是 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg )为模板,采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA,将得到的 cDNA 稀释 10 倍后,以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA hsa-miR-4682。结果如下所示:

结果如上图所示:
① 工作曲线 R2=0.9952,扩增效率 107.1%。
② 在 2μg ~ 200 pg RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰,扩增特异性强。

示例四

用本试剂盒反转录经 DNase I 处理的 RNA,然后定量PCR检测 miRNA hsa-miR-4682。操作步骤如下:

① 提取后的 HL60 Total RNA 用 DNase I(Cod. AG12001)处理:

试剂  加入量
RNA 模板 ( 1μg / μl) 10μl
10X DNase I buffer 5μl
DNase I(5U / μl) 0.5μl
RNase Free Water Up to 50μl

37℃,反应 30 min;
DNase I 的失活:
方法 1:80℃ 2min。
方法 2:加入 2.5μl 的 200mM 的 EDTA 后混匀,80℃ 2min。经 DNase I 处理的 RNA 可保存于 -80℃ 或者直接用于下述步骤 ②。

② 以 DNase I 处理的 RNA ( RNA 量是 200ng、20ng、2ng、200pg )为模板,采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA,将得到的 cDNA 稀释 10 倍后,以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA hsa-miR-4682

③ 结果显示,DNase I 处理后,对后续反转录无影响。结果如下所示:

产品说明书

Q1:miRNA cDNA 第一链合成试剂盒后续能够搭配哪一款定量试剂进行 qPCR 实验?

Answer: AG11716 / AG11717 可以搭配 AG11701、AG11702、AG11704、AG11730 等所有荧光定量试剂进行定量 PCR 试剂(染料法和探针法均可);使用染料法进行定量实验时,推荐优先搭配 AG11702 使用,特异性更强。

Q2:AG11716 / AG11717 需要单独反转内参基因吗?

Answer: 不需要单独反转内参,miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(AG11716 / AG11717)是通过加尾法的原理进行反转录,能够对单链RNA进行无差别反转录,miRNA 和内参都能一起加尾反转。但定量实验扩增内参基因时,建议使用内参特异性上下游引物扩增(不建议使用通用 3’ 端下游引物扩增内参基因)。

Q3:加尾法反转录试剂盒的优点?

Answer: ① 无需额外添加反转录引物,加尾和反转一管进行,操作方便;
② 反转一个样本,可得到该样本所有 miRNA,适合多个 miRNA 检测;
③ AG11716 / AG11717 中包含有定量所需的 3’ 端通用下游引物,只需额外设计 miRNA 上游引物即可。

Q4:AG11716 / AG11717 会对前体(pri-miRNA 和 pre-miRNA)进行反转录吗?

Answer: miRNA 加尾法反转录试剂盒会对带有 poly A 尾的单链 RNA 进行反转录。pri-miRNA 和 pre-miRNA 均为茎环结构(双链),因此当 pri-miRNA 和 pre-miRNA 不解链时,该方法不会对其进行反转录。AG11716 / AG11717 试剂盒采用独特的优化体系,最大限度抑制 miRNA 前体解链,降低前体反转录,保证 miRNA 的特异性。

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