产品详情
产品描述
本制品是应用加 A 尾法进行 miRNA 第一链 cDNA 合成的试剂盒。先使用 Poly ( A ) Polymerase 在 miRNA 3’末端加 A 尾，再使用通用反转录引物（带有特定标签的 Oligo dT引物）进行反转录反应，最终生成 miRNA 的第一链 cDNA。该制品中 miRNA RT Enzyme Mix 包含加 A 尾酶和反转录酶，2X miRNA RT Reaction Solution 含有通用反转录引物，经过优化，在同一反应体系中同时高效的完成加 A 尾和反转录反应，简化了实验操作流程，可减少试剂损失及实验误差。本制品适用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 样品的反转录。
本制品包含后续 qPCR 检测所需引物 miRNA qPCR 3’primer。
产品优势
① 本试剂盒将 miRNA 的加 A 尾反应和逆转录反应合二为一，使用方便，可减少实验误差，提高低丰度 miRNA 的检出率。
② 本试剂盒可对 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的样品进行反转录。
产品组成
| 组分 |
AG11716 |
AG11717 |
| miRNA RT Enzyme Mix*1 |
12.5μl |
62.5μl |
| 2X miRNA RT Reaction Solution*2 |
50μl |
250μl |
| miRNA qPCR 3’primer (10μM)*3 |
250μl |
625μl x 2pc |
| RNase free water |
1ml |
1ml |
*1：含有Poly(A) Polymerase、M-MLV RTase、RNase Inhibitor；
*2：含有通用反转录引物；
*3：用于qPCR反应，Tm 值为 59℃。
保存与运输
保存温度：-20℃
运输温度：干冰或者 -20℃ 冰袋
实验示例
示例一
以合成的 miRNA hsa-miR-571 ( RNA 拷贝数分别是 5*107 ~ 5*101 copies) 为模板，采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA，并以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测。结果如下所示：
结果如上图：
① 工作曲线 R2=0.9997，扩增效率 90.3%。
② 可以在宽广的模板范围内进行准确的定量，5*107~5*101 copies RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰，扩增特异性强。
示例二
以土豆 Total RNA ( RNA 量是 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg )为模板，采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA，将得到的 cDNA 稀释 10 倍后，以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA stu-miR390–3p。结果如下所示：
结果如上图：
① 工作曲线 R2=0.9977，扩增效率 105.8%。
② 在 2μg ~ 200 pg RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰，扩增特异性强。
示例三
以 HL60 Total RNA ( RNA 量是 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg )为模板，采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA，将得到的 cDNA 稀释 10 倍后，以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA hsa-miR-4682。结果如下所示：
结果如上图所示：
① 工作曲线 R2=0.9952，扩增效率 107.1%。
② 在 2μg ~ 200 pg RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰，扩增特异性强。
示例四
用本试剂盒反转录经 DNase I 处理的 RNA，然后定量PCR检测 miRNA hsa-miR-4682。操作步骤如下：
① 提取后的 HL60 Total RNA 用 DNase I（Cod. AG12001）处理：
| 试剂 |
加入量 |
| RNA 模板 ( 1μg / μl） |
10μl |
| 10X DNase I buffer |
5μl |
| DNase I（5U / μl） |
0.5μl |
| RNase Free Water |
Up to 50μl |
37℃，反应 30 min；
DNase I 的失活：
方法 1：80℃ 2min。
方法 2：加入 2.5μl 的 200mM 的 EDTA 后混匀，80℃ 2min。经 DNase I 处理的 RNA 可保存于 -80℃ 或者直接用于下述步骤 ②。
② 以 DNase I 处理的 RNA ( RNA 量是 200ng、20ng、2ng、200pg )为模板，采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA，将得到的 cDNA 稀释 10 倍后，以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA hsa-miR-4682。
③ 结果显示，DNase I 处理后，对后续反转录无影响。结果如下所示：
一般PCR系列
