产品详情
产品描述
本制品是应用加 A 尾法进行 miRNA 第一链 cDNA 合成的试剂盒。先使用 Poly ( A ) Polymerase 在 miRNA 3’末端加 A 尾,再使用通用反转录引物(带有特定标签的 Oligo dT引物)进行反转录反应,最终生成 miRNA 的第一链 cDNA。该制品中 miRNA RT Enzyme Mix 包含加 A 尾酶和反转录酶,2X miRNA RT Reaction Solution 含有通用反转录引物,经过优化,在同一反应体系中同时高效的完成加 A 尾和反转录反应,简化了实验操作流程,可减少试剂损失及实验误差。本制品适用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 样品的反转录。
本制品包含后续 qPCR 检测所需引物 miRNA qPCR 3’primer。
产品优势
① 本试剂盒将 miRNA 的加 A 尾反应和逆转录反应合二为一,使用方便,可减少实验误差,提高低丰度 miRNA 的检出率。
② 本试剂盒可对 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的样品进行反转录。
产品组成
组分 |
AG11716 |
AG11717 |
miRNA RT Enzyme Mix*1 |
12.5μl |
62.5μl |
2X miRNA RT Reaction Solution*2 |
50μl |
250μl |
miRNA qPCR 3’primer (10μM)*3 |
250μl |
625μl x 2pc |
RNase free water |
1ml |
1ml |
*1:含有Poly(A) Polymerase、M-MLV RTase、RNase Inhibitor;
*2:含有通用反转录引物;
*3:用于qPCR反应,Tm 值为 59℃。
保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋
实验示例
示例一
以合成的 miRNA hsa-miR-571 ( RNA 拷贝数分别是 5*107 ~ 5*101 copies) 为模板,采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA,并以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测。结果如下所示:

结果如上图:
① 工作曲线 R2=0.9997,扩增效率 90.3%。
② 可以在宽广的模板范围内进行准确的定量,5*107~5*101 copies RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰,扩增特异性强。
示例二
以土豆 Total RNA ( RNA 量是 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg )为模板,采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA,将得到的 cDNA 稀释 10 倍后,以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA stu-miR390–3p。结果如下所示:

结果如上图:
① 工作曲线 R2=0.9977,扩增效率 105.8%。
② 在 2μg ~ 200 pg RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰,扩增特异性强。
示例三
以 HL60 Total RNA ( RNA 量是 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg )为模板,采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA,将得到的 cDNA 稀释 10 倍后,以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA hsa-miR-4682。结果如下所示:

结果如上图所示:
① 工作曲线 R2=0.9952,扩增效率 107.1%。
② 在 2μg ~ 200 pg RNA 浓度范围内的扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一、无杂峰,扩增特异性强。
示例四
用本试剂盒反转录经 DNase I 处理的 RNA,然后定量PCR检测 miRNA hsa-miR-4682。操作步骤如下:
① 提取后的 HL60 Total RNA 用 DNase I(Cod. AG12001)处理:
试剂 |
加入量 |
RNA 模板 ( 1μg / μl) |
10μl |
10X DNase I buffer |
5μl |
DNase I(5U / μl) |
0.5μl |
RNase Free Water |
Up to 50μl |
37℃,反应 30 min;
DNase I 的失活:
方法 1:80℃ 2min。
方法 2:加入 2.5μl 的 200mM 的 EDTA 后混匀,80℃ 2min。经 DNase I 处理的 RNA 可保存于 -80℃ 或者直接用于下述步骤 ②。
② 以 DNase I 处理的 RNA ( RNA 量是 200ng、20ng、2ng、200pg )为模板,采用本试剂盒进行反转录合成 cDNA,将得到的 cDNA 稀释 10 倍后,以本公司产品 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II ( Code. AG11702 ) 进行定量 PCR 检测 miRNA hsa-miR-4682。
③ 结果显示,DNase I 处理后,对后续反转录无影响。结果如下所示:
