Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒( 含去除 gDNA 试剂, 用于 qPCR )Ver.2

¥1,500.00

货号AG11728
分类反转录系列、反转录试剂盒(qPCR专用)

产品详情

产品描述

本产品是利用 M-MLV 反转录酶的反转录试剂盒,cDNA 产物可直接用于 qPCR 检测。5X Evo M-MLV RT Reaction Mix Ver.2 中包含反转录反应所需的所有组分,并针对Oligo dT (18T) Primer、Random 6 mers Primer 用量进行了优化,使反转录产物兼容嵌合法和探针法 qPCR 分析,能够进行高效的基因表达分析。

在进行下游定量 PCR 实验中,Total RNA 中混入的 gDNA 可直接作为 PCR 反应的模板进行扩增,可能会造成实验结果的假阳性;本制品中 gDNA Clean Reaction Mix Ver.2 可有效去除残留的基因组 DNA,确保定量结果的准确性;同时,本制品中配有 NRT Control Reaction Mix,可用于配制无反转录酶的阴性对照反应。

Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒(含去除 gDNA 试剂,用于 qPCR)Ver.2 是在原有 Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒(含去除 gDNA 试剂,用于 qPCR)的基础上进行优化升级,适用于不同的操作方法,客户可以根据需求进行选择:
方法一:两步法(先去除 gDNA,再进行反转录):若提取的 RNA 中 gDNA 残留过多或对 gDNA 去除效果要求更高,建议使用此方法。
方法二:All in one(去除 gDNA 与反转录反应在一管中同时进行):当 RNA 质量较高(gDNA 残留少),或反应中 RNA 浓度较高、目标基因拷贝数高时,可选用此方法,操作简便、快捷,可简化实验操作步骤,缩短实验时长。

产品优势

① 含有基因组 DNA 去除试剂 gDNA Clean Reaction Mix Ver.2,能够快速的去除 RNA 模板中混有的基因组 DNA。
② 试剂盒中将去除基因组及反转录体系分别配制成预混液,使用方便,可减少试剂损失及实验误差。
③ 适用于不同的操作方法,客户可以根据需求进行选择:既可选择两步法,先去除 gDNA,再进行反转录;也可选择 All in one,在一管中同时完成去除基因组与反转录反应,操作方便快捷。
④ 本制品反转得到的 cDNA 同时适用于 SYBR 法和探针法 qPCR 分析。

产品组成
组分 规格
gDNA Clean Reaction Mix Ver.2 240 μl
5X Evo M-MLV RT Reaction Mix Ver.2*1 400 μl
NRT Control Reaction Mix*2 80 μl
RNase free water 1 ml x 2 pc

*1:该溶液含有 Evo M-MLV RTase、RNase Inhibitor、dNTPs、Oligo dT (18T) Primer 与 Random 6 mers Primer。
*2:该溶液不含 Evo M-MLV RTase,其余组分与 5X Evo M-MLV RT Reaction Mix Ver.2 完全相同。

保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋运输

实验示例

示例一

向 293T Cell Total RNA(分别为 200 ng、20 ng、2 ng、200 pg、20 pg、2 pg、0 pg)中分别加入 200 ng 的 Human 基因组 DNA,使用本试剂盒去除基因组 DNA,然后进行反转录实验(方法一:两步法的体系1),并以此 cDNA 为模板,取 2 μl 的 cDNA 原液,用 SYBR® Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒(Code. AG11701)进行 qPCR 扩增检测 Human 的 Actin 基因。

所用定量仪器:ABI QuantStudioTM 5 Real-Time PCR Systems。结果如下:

结果如上图所示:
① 工作曲线 R2=0.9987,扩增效率是101.4%。
② 不加 RNA 但添加 gDNA 样品中,Ct 值在 35 cycles 以内没有检出。
③ 本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,200ng ~ 2 pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。
④ 熔解曲线峰型单一,扩增特异性好。

示例二

使用本试剂盒对 293T cell Total RNA 进行反转录(方法二:All in one),Total RNA 起始量 1μg~1 pg。以反转录产物 cDNA 为模板,取 2μl 的 cDNA 原液,用 SYBR® Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒(Code. AG11701)进行 qPCR 扩增检测小鼠的 GAPDH 基因。

所用定量仪器:ABI QuantStudioTM 5 Real-Time PCR Systems。结果如下:

结果如上图所示:
① 工作曲线 R2=0.9959,扩增效率是106.7%。
② 本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,1μg ~ 1 pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一,扩增特异性好。

产品说明书

Q1:如何计算加入模板 RNA 的用量

Answer: 进行反转录实验时,在添加模板前可对 RNA 浓度进行测定,根据选择的反转录试剂盒说明书,将模板量控制在推荐 RNA 用量的范围内,并根据 RNA 的浓度计算需要加入模板的体积。

Q2:带有 5X gDNA Clean Reaction Mix 的反转录试剂盒能否跳过去除 gDNA 的步骤,直接反转录?RNA 中残留 gDNA,会影响后面的定量实验吗?

Answer:
带有 gDNA Clean 组分的试剂不可跳过去除 gDNA 的步骤直接反转录,否则会影响反转录效率;反转录实验时如果模板 RNA 中存在 gDNA 残留严重,会影响后续定量实验的准确性。

Q3:如何选择合适的反转录引物

Answer: ● 反转录实验常用的引物有三种类型:Oligo dT,随机引物和特异性引物。
● Oligo dT 能够与真核生物成熟 mRNA 的 3’ 端 Poly A 尾配对,适用于具有 Poly 尾的 RNA,对 RNA 模板质量的要求相对较高;当长链 RNA 存在一些复杂的二级结构时,或者模板 RNA 没有 polyA 尾时,建议使用随机引物,随机引物应用范围广,但合成的 cDNA 长度较短;基因特异性引物是根据目的基因设计的引物,通常在一步法中使用较多,但通过特异性引物反转录得到的 cDNA 只能扩增该目的基因。
● 在 Evo M-MLV 预混型反转录试剂盒(AG11706/AG11728)中,预混液中含有 Oligo dT 引物和随机引物,并对引物用量进行了优化,保证 RNA 的反转录效率,操作方便,同时有助于提高定量结果的重复性。

Q4:反转录实验操作注意事项

Answer: 反转录多个样本时,如果使用的是非预混试剂盒,例如 AG11711,建议将酶、引物、buffer、水预先配制成预混液,充分混匀离心后再进行分装。

Q5:可以通过检测 cDNA 浓度来判定反转录效率吗?

Answer: 反转录反应后得到的产物 cDNA 是混合物,除了 cDNA 产物以外,剩余试剂的残留,会干扰浓度测定结果,检测得到的浓度无法反映真实的 cDNA 产量。

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