Evo M-MLV 反转录试剂盒 II(含去除 gDNA 试剂, 用于 qPCR)

¥1,400.00

货号AG11711
分类反转录系列、反转录试剂盒(qPCR专用)

产品详情

产品描述

本产品是利用 M-MLV 反转录聚合酶的反转录试剂盒,cDNA 产物可直接用于 qPCR 检测。本产品是在 Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR(Code. AG11705)的基础上,将引物混合制成 RT Primer Mix, 方便使用,可减少实验误差。该试剂盒使用了具有较强 DNA 分解活性的 gDNA Clean Reagent,通过42 ℃, 2min 即可除去基因组 DNA,有效的减少基因组 DNA 对 cDNA 的定量分析造成的影响 。 使用本制品合成得到的 cDNA 适用于嵌合法和探针法 qPCR 分析。

产品优势

① 含有基因组 DNA 去除试剂 gDNA Clean Reagent,能够快速的去除 RNA 模板中混有的基因组 DNA。
② 试剂盒中 RT Primer Mix 混有 Oligo dT (18T) Primer 和 Random 6 mers Primer,并对引物用量进行了优化,操作方便、减少实验误差。
③ 本制品反转得到的 cDNA 同时可以适用于 SYBR 法和探针法 qPCR 分析。

产品组成
组分 规格
gDNA Clean Reagent 100μl
5X gDNA Clean Buffer 200μl
Evo M-MLV RTase Enzyme Mix *1 100μl
5X RTase Reaction Buffer Mix I*2 400μl
RT Primer Mix*3 100μl
RNase free water 1ml x 2pc

*1:含有 Evo M-MLV  RTase 与 RNase Inhibitor。
* 2:含有 dNTP。
* 3:含有 Oligo dT (18T) Primer 与 Random 6 mers Primer。

保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

向小鼠肝脏 Total RNA(分别为 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、0pg)中分别加入 200ng 的小鼠基因组 DNA,再使用本试剂盒去除基因组 DNA,去除基因组 DNA 后进行反转录实验,并以此 cDNA 为模板,取 2μl 的 cDNA 原液,用 SYBR® Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒(Code. AG11701)进行 qPCR 扩增检测小鼠的 GAPDH 基因。

结果如上图所示:
① 工作曲线 R2=0.995,扩增效率是 108.0%。
② 不加 RNA 但添加 gDNA 样品中,Ct 值在 35cycles 以内没有检出。
③ 本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,2μg ~ 2pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。
④ 熔解曲线峰型单一,扩增特异性好。

示例二

以不同梯度的 293T 细胞 Total RNA 为模板(2μg~20pg),用本试剂盒进行反转录,取 2μl 的 cDNA 原液,用 SYBR® Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒(Code. AG11701) 进行 qPCR 检测 Human H32F 基因。

结果如上图所示:
① 工作曲线 R2=0.999,扩增效率是 96.4 %。
② 不加 RNA 但添加鼠的肝脏 gDNA 样品中,Ct 值在 35cycles 以内没有检出。
③ 本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,2μg ~ 2pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。
④ 熔解曲线峰型单一,扩增特异性好。

示例三

使用本制品对 293T 细胞的 Total RNA 进行反转录,Total RNA 起始量 1μg~100pg。以反转录产物 cDNA 为模板,取 2μl 的 cDNA 原液,利用探针法 qPCR 检测 Humanβ-actin 基因 (qPCR 使用 Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit, Code. AG11704 进行)。

结果如上图所示:
①工作曲线 R2=0.997,扩增效率为 103.1%;
②本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,1μg ~ 100pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。

产品说明书

Q1:如何计算加入模板 RNA 的用量

Answer: 进行反转录实验时,在添加模板前可对 RNA 浓度进行测定,根据选择的反转录试剂盒说明书,将模板量控制在推荐 RNA 用量的范围内,并根据 RNA 的浓度计算需要加入模板的体积。

Q2:带有 5X gDNA Clean Reaction Mix 的反转录试剂盒能否跳过去除 gDNA 的步骤,直接反转录?RNA 中残留 gDNA,会影响后面的定量实验吗?

Answer:
带有 gDNA Clean 组分的试剂不可跳过去除 gDNA 的步骤直接反转录,否则会影响反转录效率;反转录实验时如果模板 RNA 中存在 gDNA 残留严重,会影响后续定量实验的准确性。

Q3:如何选择合适的反转录引物

Answer: ● 反转录实验常用的引物有三种类型:Oligo dT,随机引物和特异性引物。
● Oligo dT 能够与真核生物成熟 mRNA 的 3’ 端 Poly A 尾配对,适用于具有 Poly 尾的 RNA,对 RNA 模板质量的要求相对较高;当长链 RNA 存在一些复杂的二级结构时,或者模板 RNA 没有 polyA 尾时,建议使用随机引物,随机引物应用范围广,但合成的 cDNA 长度较短;基因特异性引物是根据目的基因设计的引物,通常在一步法中使用较多,但通过特异性引物反转录得到的 cDNA 只能扩增该目的基因。
● 在 Evo M-MLV 预混型反转录试剂盒(AG11706/AG11728)中,预混液中含有 Oligo dT 引物和随机引物,并对引物用量进行了优化,保证 RNA 的反转录效率,操作方便,同时有助于提高定量结果的重复性。

Q4:反转录实验操作注意事项

Answer: 反转录多个样本时,如果使用的是非预混试剂盒,例如 AG11711,建议将酶、引物、buffer、水预先配制成预混液,充分混匀离心后再进行分装。

Q5:可以通过检测 cDNA 浓度来判定反转录效率吗?

Answer: 反转录反应后得到的产物 cDNA 是混合物,除了 cDNA 产物以外,剩余试剂的残留,会干扰浓度测定结果,检测得到的浓度无法反映真实的 cDNA 产量。

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