Evo M-MLV 反转录试剂盒(含去除 gDNA 试剂, 用于 qPCR)

¥1,400.00

货号AG11705
分类反转录系列、反转录试剂盒(qPCR专用)

产品详情

产品描述

本制品是可以去除 cDNA 中混有的基因组 DNA 再进行 Real-Time RT-PCR 反应的专用试剂。基因组 DNA 会对 cDNA 的定量分析造成影响,本制品使用了具有较强 DNA 分解活性的 gDNA Clean Reagent,通过 42℃ 2 min 即可除去基因组 DNA。处理后的样品可以直接进行后续反转录反应合成 cDNA,再通过定量 PCR 进行基因分析。 使用本制品合成得到的 cDNA 适用于嵌合法和探针法 qPCR 分析。

产品优势

① 含有基因组 DNA 去除试剂 gDNA Clean Reagent,能够快速的去除 RNA 模板中混有的基因组 DNA。
② 试剂盒中分别配有 OligodT (18T) Primer (50μM)和 Random 6 mers Primer (400μM),可根据实际情况选择不同的引物进行反转录,亦可根据需要调整引物浓度。
③ 本产品反转得到的 cDNA 同时可以适用于 SYBR 法和探针法 qPCR 分析。

产品组成
组分 规格
gDNA Clean Reagent 100μl
5X gDNA Clean Buffer 200μl
Evo M-MLV RTase Enzyme Mix *1 100μl
5X RTase Reaction Buffer Mix I*2 400μl
Oligo dT (18T) Primer (50μM) 100μl
Random 6 mers Primer (400μM) 100μl
RNase free water 1ml x 2pc

*1:含有 RNase Inhibitor。
*2:含有 dNTP。

 

保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

向小鼠肝脏 Total RNA(分别为 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、0pg)分别加入 200ng 的小鼠基因组 DNA,使用本试剂盒进行基因组 DNA 去除反应,去除基因组 DNA 后进行反转录实验,并以此 cDNA 为模板,取 2μl 的 cDNA 原液,用 SYBR®Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (Code. AG11701)进行 qPCR 扩增检测小鼠的 GAPDH 基因。

结果如上图所示:
① 工作曲线 R2=0.996,扩增效率 103.1%。
② 不加 RNA 但添加 gDNA 样品,Ct 值在 35cycles 以内没有检出。
③ 本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,2μg ~ 2pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。
④ 熔解曲线峰型单一,扩增特异性好。

示例二

向 293T 细胞 Total RNA(分别为 2μg、200ng、20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、0pg)分别加入 200ng 的人基因组 DNA,使用本试剂盒进行基因组 DNA 去除反应。并以此 cDNA 为模板,取 2μl 的 cDNA 原液,用 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (Code. AG11701) 扩增 GAPDH 基因。

结果如上图所示:
①工作曲线 R2=0.995,扩增效率 103.0%。
②不加 RNA 但添加 gDNA 样品中,Ct 值在 35cycles 以内没有检出。
③本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,2μg ~ 2pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。
④熔解曲线峰型单一,扩增特异性好。

示例三

使用小鼠肝脏 Total RNA为模板,使用本试剂盒进行基因组DNA去除反应以及反转录实验,RNA 起始模板量为 2μg~2 pg。取 2μl 的 cDNA 原液,用 Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit(Code. AG11704)采用探针法 qPCR 扩增小鼠 GAPDH 基因。

结果如上图所示:
①工作曲线 R2=0.997,扩增效率为 104.0%;
②本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,2μg ~ 2pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。

产品说明书

Q1:如何计算加入模板 RNA 的用量

Answer: 进行反转录实验时,在添加模板前可对 RNA 浓度进行测定,根据选择的反转录试剂盒说明书,将模板量控制在推荐 RNA 用量的范围内,并根据 RNA 的浓度计算需要加入模板的体积。

Q2:带有 5X gDNA Clean Reaction Mix 的反转录试剂盒能否跳过去除 gDNA 的步骤,直接反转录?RNA 中残留 gDNA,会影响后面的定量实验吗?

Answer:
带有 gDNA Clean 组分的试剂不可跳过去除 gDNA 的步骤直接反转录,否则会影响反转录效率;反转录实验时如果模板 RNA 中存在 gDNA 残留严重,会影响后续定量实验的准确性。

Q3:如何选择合适的反转录引物

Answer: ● 反转录实验常用的引物有三种类型:Oligo dT,随机引物和特异性引物。
● Oligo dT 能够与真核生物成熟 mRNA 的 3’ 端 Poly A 尾配对,适用于具有 Poly 尾的 RNA,对 RNA 模板质量的要求相对较高;当长链 RNA 存在一些复杂的二级结构时,或者模板 RNA 没有 polyA 尾时,建议使用随机引物,随机引物应用范围广,但合成的 cDNA 长度较短;基因特异性引物是根据目的基因设计的引物,通常在一步法中使用较多,但通过特异性引物反转录得到的 cDNA 只能扩增该目的基因。
● 在 Evo M-MLV 预混型反转录试剂盒(AG11706/AG11728)中,预混液中含有 Oligo dT 引物和随机引物,并对引物用量进行了优化,保证 RNA 的反转录效率,操作方便,同时有助于提高定量结果的重复性。

Q4:反转录实验操作注意事项

Answer: 反转录多个样本时,如果使用的是非预混试剂盒,例如 AG11711,建议将酶、引物、buffer、水预先配制成预混液,充分混匀离心后再进行分装。

Q5:可以通过检测 cDNA 浓度来判定反转录效率吗?

Answer: 反转录反应后得到的产物 cDNA 是混合物,除了 cDNA 产物以外,剩余试剂的残留,会干扰浓度测定结果,检测得到的浓度无法反映真实的 cDNA 产量。

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