Evo M-MLV 反转录试剂预混液(用于 qPCR )

¥1,600.00

货号AG11706
分类反转录系列、反转录试剂盒(qPCR专用)

产品详情

产品描述

本制品是 Real Time RT-PCR 专用的反转录试剂预混液。使用了延伸能力较强的 Evo M-MLV 反转录酶,只需要 15min 即可有效合成 cDNA,合成得到的 cDNA 可用于嵌合法和探针法 qPCR 分析。5X Evo M-MLV RT Master Mix含有反转录反应所需的所有组分,只需加入 RNA 模板与水即可直接进行反应,使用方便,可减少试剂损失及实验误差。本制品针对 Oligo dT (18T) Primer、Random 6 mers Primer 用量进行了优化,使反转录产物兼容嵌合法和探针法 qPCR 分析,能够进行高效的基因表达分析。

产品优势

① 可快速高效合成 cDNA,仅需 15min 就可合成 cDNA,可用于嵌合法和探针法 qPCR 分析。
② 本制品为预混 Premix,只需加入 RNA 模板与水即可直接进行反应。
③ 本制品针对 Oligo dT (18T) Primer、Random 6 mers Primer 用量进行了优化,使反转录产物兼容嵌合法和探针法 qPCR 分析。

产品组成
组分 规格
5X Evo M-MLV RT Master Mix *1 400μl
RNase free water 1ml x 2pc

*1:含有Evo M-MLV RTase、RNase Inhibitor、dNTP、Oligo dT (18T) Primer、Random 6 mers Primer、反应 Buffer。

保存与运输
保存温度:-20℃
运输温度:干冰或者 -20℃ 冰袋

实验示例

示例一

使用本制品对小鼠 Total RNA 进行反转录,再以此 cDNA 为模板,取 2μl 的 cDNA 原液,通过嵌合法 qPCR 检测小鼠 GAPDH 基因 (本实验例 qPCR 使用 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit, Code. AG11701 进行)。RNA 起始量 1μg~1pg。

结果如上图所示:
① 扩增效率为 108.3%,R2=0.992。
② 本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,1μg ~ 1pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一,扩增特异性好。

示例二

使用本制品对 293T 细胞的 Total RNA 进行反转录,RNA起始量 1μg~10pg。 再以此 cDNA 为模板,取 2μl 的 cDNA 原液,通过嵌合法 qPCR 检测 Human H32F 基因 (TFRC) (本实验例 qPCR 使用 SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit, Code. AG11701 进行)。

结果如上图所示:
① 扩增效率为 97.8%,R2=0.997。
② 本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,1μg ~ 10pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。
③ 熔解曲线峰型单一,扩增特异性好。

示例三

使用本制品对 293T 细胞的 Total RNA 进行反转录,RNA 起始量 1μg ~1pg。 再以此 cDNA 为模板,取 2μl 的 cDNA 原液,利用探针法 qPCR 检测 Humanβ-actin 基因(qPCR 使用 Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit, Code No. AG11704 进行)。

结果如上图所示:
① 扩增效率为 93.1%,R2=0.999。
② 本制品的反转效率高,能在宽广的模板范围内进行准确的定量,1μg ~ 1pg Total RNA 反转录获得的 cDNA 扩增曲线呈现良好的线性关系。

产品说明书

Q1:如何计算加入模板 RNA 的用量

Answer: 进行反转录实验时,在添加模板前可对 RNA 浓度进行测定,根据选择的反转录试剂盒说明书,将模板量控制在推荐 RNA 用量的范围内,并根据 RNA 的浓度计算需要加入模板的体积。

Q2:带有 5X gDNA Clean Reaction Mix 的反转录试剂盒能否跳过去除 gDNA 的步骤,直接反转录?RNA 中残留 gDNA,会影响后面的定量实验吗?

Answer:
带有 gDNA Clean 组分的试剂不可跳过去除 gDNA 的步骤直接反转录,否则会影响反转录效率;反转录实验时如果模板 RNA 中存在 gDNA 残留严重,会影响后续定量实验的准确性。

Q3:如何选择合适的反转录引物

Answer: ● 反转录实验常用的引物有三种类型:Oligo dT,随机引物和特异性引物。
● Oligo dT 能够与真核生物成熟 mRNA 的 3’ 端 Poly A 尾配对,适用于具有 Poly 尾的 RNA,对 RNA 模板质量的要求相对较高;当长链 RNA 存在一些复杂的二级结构时,或者模板 RNA 没有 polyA 尾时,建议使用随机引物,随机引物应用范围广,但合成的 cDNA 长度较短;基因特异性引物是根据目的基因设计的引物,通常在一步法中使用较多,但通过特异性引物反转录得到的 cDNA 只能扩增该目的基因。
● 在 Evo M-MLV 预混型反转录试剂盒(AG11706/AG11728)中,预混液中含有 Oligo dT 引物和随机引物,并对引物用量进行了优化,保证 RNA 的反转录效率,操作方便,同时有助于提高定量结果的重复性。

Q4:反转录实验操作注意事项

Answer: 反转录多个样本时,如果使用的是非预混试剂盒,例如 AG11711,建议将酶、引物、buffer、水预先配制成预混液,充分混匀离心后再进行分装。

Q5:可以通过检测 cDNA 浓度来判定反转录效率吗?

Answer: 反转录反应后得到的产物 cDNA 是混合物,除了 cDNA 产物以外,剩余试剂的残留,会干扰浓度测定结果,检测得到的浓度无法反映真实的 cDNA 产量。

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